Laboratorio

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Cuaderno

Transformación por electroporación. Minipreparaciones de ADN plasmídico (minipreps). Ensayo de resistencias naturales.

Estrategia de Clonado

Solo podemos usar plásmidos con resistencia a kanamicina, y todas las partes deben estar ensambladas en un solo vector con esta resistencia (como el pBBR2 que conseguimos). Decidimos "levantar" los 3 genes del genoma de Pseudomonas areuginosa PAO1, incluyendo posibles regiones promotoras y terminadoras: al menos 200pb río arriba del ATG, intentando excluir regiones codificantes o funcionales de otros genes. Diseñar primers. Agregar regiones de homología para Gibson Assembly, a partir del producto de PCR anterior y usando primers más largos. Las secuencias de homología deben ser diseñadas; las ideas iniciales fueron usar RBS de pseudomonas y/o buscar regiones "intercistrón" en otros genes policistrónicos de esta bacteria.

Diseño de Primers para amplificación por PCR

En principio, usamos las secuencias de los genes como aparecen en http://www.pseudomonas.com/ y las pasamos a distintos archivos en Benchling (https://benchling.com/), que permite manipular secuencias de forma más gráfica y amigable. Usando este programa web, anotamos las regiones relevantes de los genes phzS, phzM y PA2567. Benchling dispone de una herramienta para diseñar primers, pero inicialmente decidimos usar PrimerBLAST de NCBI filtrando primers inespecíficos contra el genoma de PAO1. Los primeros intentos produjeron oligos con alto porcentage de GC en las bases hacia el extremo 3'OH y temperaturas de melting inferiores a los 60°C. Los coordinadores sugirieron aumentar la temperatura de melting objetivo para disminuir la probabilidad de amplificación inespecífica. Ademaś usamos las opciones avanzadas para limitar la cantidad de GC hacia el extremo 3'OH y repetimos la búsqueda. También usamos el programa Primer3Plus (http://primer3plus.com/) que tiene muchas opciones, pero no busca annealing inespecífico en el resto del genoma. Los primers diseñados con esta herramienta deben ser verificados usando PrimerBLAST (especificando el par de primers a utilizar). Después de generar secuencias de pares de primers, estas fueron analizadas usando OligoAnalyzerIDT (https://www.idtdna.com/calc/analyzer) y NetPrimer (http://www.premierbiosoft.com/NetPrimer/) para intentar predecir por otro lado la formación de estructuras secundarias y dímeros de primers que pudieran interferir con la reacción de PCR.

Screening de resistencias de Pf-05

Materiales y métodos

  • Cultivo en agar LB de Pseudomonas protegens (Pf-05)
  • Placas con antibióticos (una con cloranfenicol, otra con gentamicina, otra con kanamicina, otra con tretraciclina, otra con ampicilina y una última como control sin antibiótico) y medio mínimo sin glucosa y "NYGB 2%"

Para evaluar las resistencias naturales de Pf-05, tomamos una muestra con un ansa de un cultivo en agar LB de Pseudomonas protegens(Pf-05) y plaqueamos en medios con distintos antibióticos. Luego, cultivamos las placas a 28ºC toda la noche. Al día siguiente observamos los resultados (positivo en caso de observar crecimiento, negativo en caso de no observar crecimiento)

Resultados

Antibiótico en placa Crecimiento
Alta concentración Cloranfenicol +
Baja concetración Cloranfenicol +
Gentamicina +
Kanamicina -
Tetraciclina +
Ampicilina +
Control +

Así, observamos que el plásmido Pf-05 contiene casettes de resistencia a varios antibióticos como el Cloranfenicol, Gentamicina, Tetraciclina y Ampicilina.

David sugiere: "Lo importante es donde, la temperatura y si pega en otro lado". "Puedes pasarte optimizando diferentes cosas pero igual no te va a salir mejor por eso".

Extracción de ADNg de Pseudomonas areuginosa PAO1

Para obtener los genes necesarios para la producción de piocianina, se busca extraer el ADN genómico de Pseudomonas aeruginosa, ya que esta cepa produce naturalmente la molécula.

Materiales y métodos

Cultivo líquido de Pesudomonas areuginosa PAO1

  • LB líquido
  • Cultivo de Pseudomonas aeruginosa (rojo, la cepa lleva un plásmido de expresión de mCherry constitutivo)
  • Gentamicina

Para ello se realizaron cultivos de nuestra cepa de Pseudomonas aeruginosa en tubos de ensayo en LB líquido. Se realizaron 3 réplicas de 5ml de medio de cultivo con una concentración de gentamicina de 100 microgramos/ml, incubadas a 37*C. Se espera que pasado este tiempo aparezca el color característico de la cepa.

Extracción de ADN genómico

Procedimiento del equipo iGEM 2011 Calgary)

Materiales

  • Cultivo celular saturado
  • Buffer de lisis (40 mM Tris-acetato pH 7,8 , 20 mM acetato de sodio, 1 mM EDTA, 1% SDS)
  • Cloruro de Sodio 5M
  • Cloroformo
  • Etanol 100%
  • Etanol 70%
  • ddH2O

Protocolo:

1. Centrifugar 1,5ml de cultivo saturado por 3 minutos a 12000 rpm

2. Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet con 200 ul de buffer de lisis. Mezclar con pipeteo vigoroso.

3. Agregar 66 ul de cloruro de sodio 5M para remover proteínas y restos celulares. Mezclar bien.

4. Centrifugar 10 minutos a 12000 rpm a 4*C

5. Transferir el sobrenadante claro a un nuevo tubo y precipitar el ADN agregando etanol 100% e incubando a -20*C por al menos 1 hora.

6. Centrifugar 10 minutos a 4*C

7. Descartar el sobrenadante y lavar el pellet con etanol 70% 2 veces.

8. Secar el pellet en centrífuga de vacío o sobre una toalla de papel limpia por 30 minutos.

9. Resuspender el pellet en 50 ul de ddH2O y medir la concentración de ADN usando Nanodrop.

Resultados

Observamos coloración rojiza en el precipitado. Como la cepa sobreexpresa la proteína mCherry, Es psoible que el paso de extracción de proteínas realizado no haya sido suficiente. Quizás podría volverse un indicador de calidad.