Laboratorio

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2015

Realización del diseño insilico y compra de los reactivos.
En diciembre resuspendimos los plasmidos BBa_K911003 y BBa_K1357009 de las placas iGem 2015 correspondientes al promotor+riboswitch y el RBS+AmilCP+Terminador+Terminador. Fueron transformadas utilizando el método de shock termico, y se amplifico el plasmido. Continuamos con la realización de minipreps utilizando kit comercial de la marca Promega® para la purificación.

Enero

25/01/16 Digestiones

Digestión (rápida) del riboswitch (BBa_K911003) y amilCP (BBa_K1357009). Gel 4x y 1x. Miniprep de amilCP y riboswitch. Reunión con instructores.

26/01/16 Digestiones

La digestión realizada dio como resultado la liberación del fragmento del constructo correspondiente al amilCP pero no fue liberado el fragmento correspondiente al Riboswitch.


Vector Inserto
DNA 10 µl DNA 15 µl
Buffer 4 3 µl Buffer 4 3 µl
BSA 0,3 µl BSA 0,3 µl
EcoRI 0,3 µl EcoRI 0,3 µl
XbaI 0,3 µl SpeI 0,3 µl
H20 16,1 µl H20 1,1 µl

27/01/16 Chequeo de enzimas

Durante la primera estrategia de clonado, no se liberaba la parte correspondiente al riboswitch, la cual observábamos en la corrida electroforesis en gel de agarosa.
Luego de varios intentos, para descartar posibles contaminaciones y/o error humano decidimos realizar un nuevo experimento para verificar si había algún problema en los sitios de restricción estandard de los plasmidos iGem, intentamos con todas la posibles combinaciones de enzimas de restricción y nos dimos cuenta que el sitio EcoRI podia estar mutado y por esa razón era cortado. Debido a esta complicación cambiamos de estrategia, utilizando el plasmido de BBa_K911003 correspondiente al riboswitch como vector (digerido con SpeI y PstI para darle direccionalidad) e insertando el constructo del plasmido BBa_K1357009 (digerido con XbaI y PstI).


Tecnox1.png

Digestiones preparativas(NEB)

Inserto(AmilCP) Vector(Riboswitch)
DNA 10 µl DNA 5 µl
Buffer 3 µl Buffer 3 µl
XbaI 0,5 µl SpeI 0,5 µl
PstI 0,5 µl PstI 0,5 µl
BSA 0,3 µl BSA 0,3 µl
H2O 15,7 µl H2O 20,7 µl
Vt 30 µl Vt 30 µl

Purificación de ADN (a partir de gel de agarosa 1%)

  • 500 µl de wash
  • 15ml wash 80ml EtOH
  • x 0,5ml solución
  • x= 0,1ml}
  • Peso de las bandas → 0,237 gr x 3 = 0,711ml de buffer de solubilización

Cortar tacos de agarosa y purificarlos

Para purificar los tacos se utilizo el kit comercial de Promega®. Es necesario conocer el peso de los tacos de agarosa tanto del inserto como del vector los cuales ambos pesan 0,237 gr. Este dato se utiliza para calcular el volumen que debe agregarse del buffer gel solubilization del kit mediante la siguiente cuenta: Peso del taco*3=Volumen de buffer que debe agregarse. Por otro lado es necesario preparar la solución wash que es Wash + EtOH conociendo que para 16 ml de wash se deben preparar en 80 ml de solución. Nosotros usamos 0,1 ml de wash por lo que deben prepararse 0,5 ml (100 ul de wash + 400 ul de EtOH). Para la elución utilizar 30 ul de Buffer de elución.

Ligación

  • Vector: 6 µl
  • Inserto: 11,5 µl
  • Buffer: 2 µl (vortexear para mezclar ATP)
  • Ligasa: 0,5 µl
  • Centrifugar la mezcla y dejar a 4°C

Se picaron colonias que fueron dejadas overnight a 37 °C.

02/02/16

  • Se transformó tres colonias con electroporador (en la Fundación Leloir) y otras tres colonias con método químico.
  • Falcon bacterias(electroporadas y otros con las quimicas): Centrifugar a 3000rpm. Descartar sobrenadante con lo que queda, resuspender y plaquear overnight a 37°C.
  • Bacterias nova blue: 500 µl bacterias + 500 µl glicerol. Guardar a -80°C.
  • Eppendorf de Nova Blue.

03/02/16

  • Se largo otra digestión de amilCP y Riboswitch.
  • Se armaron cultivos picando colonias de las placas.
  • Las bacterias transformadas crecieron poco.

04/02/16

  • Electroforesis: se corrieron las digestiones en gel de agarosa 1%.
  • Cortar bandas.

10/02/16 Protocolo miniprep casera

  1. Crecer un cultivo a 37°C over night.
  2. Centrifugar a 3000 rpm por 5’.
  3. Retirar el sobrenadante y agregar 100 µl de P1
  4. Agregar 200 µl de P2. Invertir 4 veces.
  5. Agregar 150 µl de P3. Centrifugar a máxima velocidad 10 minutos.
  6. Sacar sobrenadante y agregar 500 µl de cloranfenicol-
  7. Vortex y centrifugar a máxima por 1 minuto.
  8. Sacar sobrenadante + 700 µl de isopropanol. Vortex y centrifugar a máxima por 15 minutos.
  9. Agregar 500 µl de EtOH 70% . Centrifugar 5 minutos a máxima.
  10. Sacar EtOH y resuspender en agua.

P1(Tris HCl + EDTA) P2(SDS 1% + NaOH 0,2M) P3(AcK ph5) 3M

11/02/16

  • Se transformó la ligación.

15/2/16: Cultivo

  • Las ligaciónes dieron bien.
  • Se picaron colonias del biosensor de fluor: colonia + LB + cloranfenicol

16/2/16: Cultivo

  • Se llevó a cabo una miniprep casera de las colonias picadas ayer.

17/2/16: Chequeo con enzimas XbaI y PstI

  1. Preparar la siguiente master mix:
Tecnox3.png
Buffer 2 13 µl
BSA 0,65 µl
XbaI 0,65 µl
PstI 0,65 µl
DNA -
Agua 21,25 µl
RNAsa 0,65 µl
Vt 98,85 µl

8 µl de Mix y 2 µl DNA

  1. Se lo corrió en un gel de agarosa al 1%: 100 V, 20 minutos
MW 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12


Los clones 2,3,9,12 y 13 liberaron.

23/02/16 Cultivos

  • Se largaron los cultivos de los clones positivos y negativos para hacer la prueba del biosensor. Incubar overnight a 37°C.

24/02/16 Primera prueba del biosensor

CaF2 1 M Para todos los clones (+1, +12, -4) realizamos lo siguiente:

  • 3 ml LB Roux + 1 ml de bacteria + 0 µl de sal + 4,44 µl cloranfenicol => 0 mM
  • 3 ml LB Roux + 1 ml de bacteria + 444 µl de sal + 4,44 µl cloranfenicol => 100 mM
  • 3 ml LB Roux + 1 ml de bacteria + 1714 µl de sal + 5,71 µl cloranfenicol => 300 mM
  • 3 ml LB Roux + 1 ml de bacteria + 6000 µl de sal + 10 ul de µl cloranfenicol => 600 mM

Incubamos a 37°C en agitación y se controló el color cada 15 minutos. Como no se observó color se dejó incubando O.N en agitación a 37°.

  • Miniprep casera con lo que sobro de los cultivos

Marzo

1/3/16: Segunda prueba del biosensor con un control negativo

Preparamos NaF 0,9 M porque es la concentración mayor antes de llegar a saturación y se preparó un control negativo NaCl 1 M Se evaluaron cuatro concentraciones de cada sal: 0 mM, 100 mM, 300 mM y 600 mM.

NaF
Medio de cultivo (LB Roux) 3000 µl
Clon ( +1, +12, -4) 1000 µl
Sal (NaF 0,9 M) 0 µl (0 mM), 500 µl (100 mM), 2000 µl (300 mM), 8000 µl (600 mM)
Clorafenicol 1000x 4 µl (0 Mm), 4,5 µl (100 mM), 6 µl (300 mM), 12 µl (600 mM)
NaCl
Medio de cultivo (LB Roux) 3000 µl
Clon ( +1, +12, -4) 1000 µl
Sal (NaCl 1 M) 0 µl (0 mM), 444 ul (100 mM), 1714 ul (300 mM), 6000 ul (600 mM)
Cloranfenicol 1000X 4 µl (0 Mm), 4,44 µl (100 mM), 5,71 µl (300 mM), 10 µl (600 mM)

No alcanzó el cultivo para largar todo; solo alcanzo para 0,100 y 300 de NaCl. Falta para todas las concentraciones de NaF y para la de 600 mM de NaCl.

2/3/16: Centrifugación para observar color

Lab.jpeg
  • Se observó la presencia de color tras bajar las bacterias por lo que se supone que al momento de largar la prueba ya estaban expresando amilCP por trazas de flúor remanentes en el tubo utilizado.
  • Se largó una nueva prueba con NaF y sin NaCl. Pero utilizando 500 µl de bacterias.
NaF
Medio de cultivo (LB Roux) 3000 µl
Clon ( +1, +12, -4) 500 ul
Sal (NaF 0,9 M) 0 ul (0 mM), 444 ul (100 mM), 1750 ul (300 mM), 7000 ul (600 mM)
Cloranfenicol 1000x 3,5 ul (0 Mm), 3,9 ul (100 mM), 5,25 ul (300 mM), 10 ul (600 mM)
  • Se picaron colonias en LB

14/3/16

Se repitió la prueba del biosensor varias veces y dieron los mismos resultados. Entonces decidimos hacer diluciones seriadas.