Señal

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Introducción

La señal elegida para poner en evidencia la presencia de la bacteria Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH) se forma a partir de dos fragmentos protéicos (fragmentos NGFP y CGFP) que al unirse mediante la interacción de los denominados leucine zippers (NZ y CZ), forman una proteína (GFP) que emite una señal fluorescente (Figura 1).


Figura 1. Esquema de formación de la señal

Proteínas fluorescentes

Figura 2 Representación en modelo de cintas de la proteína fluorescente verde (GFP).

La proteína fluorescente verde (GFP por sus siglas en inglés) es una proteína que emite fluorescencia verde cuando es iluminada con luz de ciertas longitudes de onda (Figura 2). Esta proteína se produce naturalmente en la medusa Aequorea victoria y tiene una estructura de barril beta característica, constituida por aproximadamente 240 aminoácidos. La primera variante recombinante en caracterizarse biofísicamente posee un pico de excitación en 475 nm y otro a 395nm, mientras que el pico de emisión se encuentra a 509 nm en la zona verde del espectro.

Existe un número importante de variantes de GFP ingenierizadas en el laboratorio, algunas de ellas más estables o que se degradan más rápido y otras que emiten en distintas regiones del espectro visible. Entre las variantes disponibles podemos mencionar una que resultó muy útil para nuestro proyecto. Se trata de una GFP que se encuentra seccionada entre los residuos 157 y 158, resultando en dos fragmentos N- y C- terminales de 157 y 81 residuos respectivamente.

Figura 3. Representación en modelo de cintas de las estructuras alfa hélices que forman el Leucine zippers

Los leucine zippers son arreglos estructurales formados por la interacción de elementos anfipáticos (una cara polar y una apolar) con estructura secundaria de tipo hélice alfa (Figura 3). Cada hélice alfa anfipática se une a la otra por medio de su parte hidrófoba (la parte apolar), en un arreglo que se denomina coiled coil. Este proceso es análogo al cierre de una cremallera. Al interaccionar, ambas hélices forman una unión estable que no se separa fácilmente. La interacción entre ambas hélices puede darse mediante homodímeros o heterodímeros, dependiendo si la interacción se da entre hélices idénticas (homo) o distintas (hetero), y dependiendo en qué sentido (N - C terminal) se encuentren ambas hélices, se las clasifica en paralelas (ambas en el mismo sentido) o antiparalelas (en distinto sentido).

Figura 4. Representación en modelo de cinta del Leucine zipper con los residuos que interaccionan

En la Figura 4. se muestran en gris el recorrido de las cadenas principales, formando las hélices alfa y los residuos de aminoácidos cuyas cadenas laterales participan en la asociación de las cadenas. Se observa que en las posiciones a y d de las cadenas aparecen residuos apolares que median la interacción hidrofóbica, como Leucina (L) en la posición d y Valina (V) en la posición a.

La especificidad de dimerización que lleva a que ciertos zippers heterodimerizen, está dada por la interacción polar de residuos nonconsensus en las posiciones e y g, y por la aparición excepcional de residuos polares en las posiciones a y d.

Aplicación del sistema leucine zipper - GFP

La capacidad que poseen estos motivos para interaccionar estableciendo su unión, puede ser utilizada como estrategia para favorecer la unión de dos proteínas al adicionar estos motivos en cada una de ellas.
Ghosh y col.(2000), ha descripto el uso de leucine zippers para la reconstitución de la proteína fluorescente verde (GFP) a partir de los fragmentos de esta. En este caso, los leucine zippers al interaccionar contribuyen al acercamiento de los dos fragmentos de la proteína GFP, favoreciendo la estabilización de ambas partes y en consecuencia la reconstitución de la proteína completa.

En su trabajo Ghosh y col.(2000), constataron, por medio de la medición de fluorescencia, que en ausencia de los leucine zippers incorporados a los fragmentos C- y N- terminal de la GFP, no se observaba fluorescencia cuando eran coexpresados en bacterias. El agregado de los leucine zippers a los fragmentos permitía la reconstitución de la GFP, evidenciándose dicha unión como aparición de señal fluorescente.

Nuestro proyecto se basa en la identificación de dos ARNm cuya detección simultánea nos permite identificar a las bacterias de interés con un 100 % de confianza. Por lo tanto, buscamos una estrategia que nos permitiera diseñar un sistema en el cual la señal que detectaríamos se genere únicamente en presencia de ambos ARNm. Para tal fin, diseñamos cada uno de los toehold switches (ver sección Toehold Switches) de forma tal que al reconocer a su ARNm blanco, se traduzca la secuencia aminoacídica correspondiente a una cada una de los dos fragmentos de la proteína GFP. Entonces, para favorecer la reconstitución de la proteína GFP funcional, es que decidimos incorporar a la secuencia codificante de cada mitad de la proteína GFP los leucine zippers. De este modo, logramos una configuración de circuito lógico “AND”, en la cual sólo en presencia de ambos ARNm se expresaran ambos fragmentos de la GFP que por complementariedad emitirán la señal fluorescente(ver Fundamento). Es importante destacar que el reconocimiento de un único ARNm (bacteria no patógena) conducirá a la activación de un solo toehold switch lo que resultaría en un solo fragmento de la GFP y esto no sería suficiente para generar la señal fluorescente.

En resumen, el uso de los fragmentos de GFP unidos a los leucine zippers favorece la reconstitución de la GFP y permitirá ver si hubo interacción entre los switches y sus respectivos ARNm, observando la emisión de la señal.

Estrategia implementada

En primera instancia valuaremos la funcionalidad de cada toehold switch por separado en vez de evaluar el sistema completo, en el cual dos toehold switches al reconocer su ARNm blanco expresan cada uno de los fragmento de GFP que se complementan emitiendo una señal fluorescente. Por este motivo, el toehold switch evaluado debe emitir una señal al activarse por su interacción con su ARNm blaco independientemente de la activación del otro switch. De esta forma, decidimos que cada toehold switch contenga la información para la expresión de una proteína fluorescente roja entera (RFP por sus siglas en inglés), cuya expresión y emisión de fluorescencia permitirá evaluar la funcionalidad de cada switch por separado.

De esta manera se probará:

1-SwitchUreD-RFP + TriggerUreD
2-SwitchEspK-RFP + TriggerEspK
3-SwitchUreD-CZGFP + SwitchEspK–NZGFP + TriggerUreD + TriggerEspK

La proteína RFP utilizada es la mRFP1, la cual constituye la parte de iGEM BBa_E1010. Esta proteína está formada por 225 aminoácidos y presenta un pico de excitación a 584nm y uno de emisión a 607nm.


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