Resultados

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Registro Diario

Julio

Esta semana algunos integrantes del equipo participamos de un curso de Introducción a la Biología Sintética, dictado por Ignacio Sánchez y Alejandro Nadra en la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la UBA. Aprendimos mucho más sobre lo que es la Biología Sintética y la variedad de herramientas disponibles que aprovecharemos para nuestro proyecto.

Además conocimos a un gran grupo de personas, de distintas disciplinas, todos con las mismas ganas de saber más sobre esta nueva rama de la Biología.

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Agosto

Reunion.jpg Emprendimos las primeras reuniones del grupo conformado: Comenzó la tormenta de ideas! Y por supuesto, también la búsqueda bibliográfica.

Para poder sustentar las ideas iniciamos la investigación sobre los bacteriófagos y sus usos en biología sintética. Además también iniciamos las tareas experimentales preparando medios de cultivo y un stock de bacterias competentes. Para compartir los diferentes conocimientos de los integrantes del grupo organizamos una clase de conceptos generales sobre circuitos lógicos y diseño de primers.


Septiembre

Semana del 8/9

Ya con algunas ideas en mente investigamos posibles secuencias blanco de ECEH e indagamos los proyectos de los grupos de IGEM que trabajaron con E. coli 0157:H7

Semana del 14/9
Estos días hicimos la presentación de las ideas preseleccionadas. Debatimos el fundamento, las ventajas y desventajas de cada uno y los grupos de la población que se verían beneficiados con el desarrollo del proyecto. Para sumar información y despejar dudas, recibimos la visita de Dolores Blanco de la Cátedra de Virología (FFyB), la cual nos presentó un seminario sobre bacteriófagos, y respondió a todas nuestras preguntas sobre este tema.

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Semana del 21/9
Estos días hicimos la presentación de las ideas preseleccionadas. Debatimos el fundamento, las ventajas y desventajas de cada uno y los grupos de la población que se verían beneficiados con el desarrollo del proyecto. Para sumar información y despejar dudas, recibimos la visita de Dolores Blanco de la Cátedra de Virología (FFyB), la cual nos presentó un seminario sobre bacteriófagos, y respondió a todas nuestras preguntas sobre este tema.


Octubre

Semana del 5/10
Esta semana tuvimos una reunión con Alejandro Nusblat de la Cátedra de Biotecnología (FFyB) en la cual nos contó cómo se efectúa el diseño de plásmidos dándonos consejos que nos servirán a la hora de encargar el nuestro. Por otro lado, profundizamos el estudio de la idea seleccionada. Evaluamos los posibles promotores y reporteros que podríamos usar y como sería el plásmido. Además, comenzamos el desafío de escribir nuestro proyecto, sus posibles alcances, y su relevancia, en un documento formal para presentar ante posibles auspiciadores y personas interesadas. También compartimos el conocimiento ganado en el seminario de ciencia ficción en la ciencia; como la indagación de las consecuencias en una idea sencilla pueden terminar por ser la solución ideal al problema que buscamos resolver.

Semana del 12/10
Seguimos escribiendo el proyecto, haceindo hincapié en los objetivos puntuales, y epidemiología del SUH. Taller pensamiento visual:

Octubre.jpg Semana del 19/10

Estos días discutimos si deberíamos utilizar un promotor inducible o constitutivo para expresar nuestras secuencias. En particular analizamos los promotores Ara y Lac y buscamos en IGEM los promotores más usados (pBla, PALAT + ARAc) También buscamos el transcriptoma de E coli (ADDGENE) para evaluar las secuencias blanco a seleccionar.
Semana del 26/10
Finalmente luego de días de intenso trabajo terminamos la escritura del proyecto. Además lo enviamos para participar de la competencia BIOTEK+75K (UNSAM), donde se lo presentan a empresarios e inversores para generar cooperación.

Noviembre

Semana del 2/11

Pensando en la importancia que tendrá el proyecto en nuestra comunidad y la comunidad en nuestro proyecto; comenzamos a pensar caminos de difusión para conseguir a la difusión de las redes sociales y la popularización de nuestra iniciativa. En esta fecha abrimos nuestra Fan page de Facebook! Ahora arrancamos con la campaña de crowd funding en Ideame “Buscando a E.coli”. Elaboramos nuestro perfil y produjimos un video promocional de la campaña. Además, July habló en el programa de radio Todos a Marte para contar sobre el proyecto y promocionar nuestra campaña en Ideame.
Por otro lado, esta semana recibimos la visita de Matías Peire, cofundador de Grid, el cual luego de presentarle el proyecto nos brindó consejos y recomendaciones en base a su conocimiento sobre la creación de empresas de base científica.

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Semana del 9/11
El viernes de esta semana tuvimos uno de los días más emotivos en nuestra experiencia, ya que hicimos la presentación oficial del proyecto ante la facultad. Tras una ardua difusión en nuestras incipientes comunidades de redes sociales, y bajo el beneplácito del decanato de la facultad, presentamos nuestra idea con su importancia y los desafíos que esperábamos encontrar. Recibimos el apoyo sincero de compañeros y profesores entusiasmados con la posibilidad de que nuestra facultad se uniera al desafío del desarrollo tecnológico para mejorar nuestras sociedades.

Otro evento importante del día fue nuestra visita a la oficina de la doctora Famiglieti para consultarle por las dificultades particulares en la determinación de cepas enterohemorrágicas de E. coli.
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Semana del 16/11
Uno de los desafíos más importantes era el diseño de los toehold switches. El largo proceso de diseño comenzó en primer lugar con el análisis de las secuencias enteras de nuestros ARN blancos y sus estructuras secundarias, necesitábamos porciones de treinta nucleótidos con altas probabilidades de tener estructura secundaria lineal. Utilizamos los programas de RNAfold de la universidad de Vienna y NUPACK para predecir las estructuras secundarias que adoptarían.

Semana del 23/11
La difusión y nuestra relación con la comunidad era nuestra prioridad del momento. Pensando en eso profundizamos nuestra difusión y abrimos canales nuevos como Instagram, Tweeter y comenzamos el diseño de nuestra wiki.

Diciembre

Semana del 1/12

Para elegir las secuencias blanco una vez que se constató su linealidad, se hizo un análisis de tipo BLAST de las secuencias para estar seguros de la especificidad de esa secuencia como marcadora de presencia de nuestros genes. También se trabajó en el diseño de nuestro logo, las configuraciones de la wiki y nuestras relaciones con la comunidad. ¡UN GRAN MOTIVO DE CELEBRACION PARA EL EQUIPO! Nuestra difusión en redes sociales y el trato con la comunidad han surtido su efecto y nos han acercado a Federico de Santadina, el representante principal de la Fundación Ciro. Su fundación está comprometida en la lucha contra el SUH y él se entusiasmó al lado nuestro con el proyecto. Nos dio su apoyo y accedió a ser nuestro sponsor en la financiación del proyecto.

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Semana del 8/12
Un tema de mucha importancia dentro del proyecto es el de nuestra GFP de dos partes, así que en esta semana nos dedicamos al análisis de las fuentes bibliográficas que las describían y procuramos constatar la funcionalidad y estabilidad de la GFP. Además, estos días nos enfocamos en el diseño in silico de los toehold switches, definiendo cuál sería el algoritmo a utilizar. Para ello establecimos cuál debía ser la estructura secundaria del switch y cómo debían ser las regiones de la secuencia fijas: el sitio de unión a ribosoma, el AUG, y el sitio de restricción.

Semana del 14/12
Continuamos con el diseño de los toehold switches y comenzamos a organizar la biblioteca a partir de la cual escogeremos a los candidatos para ser los protagonistas de nuestro proyecto. También armamos cotizaciones de los reactivos que debemos encargar para poder llevar a cabo los experimentos.

Por otro lado, analizamos los posibles plásmidos que podríamos utilizar para los switches y las secuencias blanco teniendo en cuenta los promotores que deberían tener y las combinaciones posibles. El viernes 18 de diciembre asistimos a la charla en Exactas de los chicos de “El gato y la caja”. La charla fue muy enriquecedora en varios aspectos, resaltando especialmente lo referido a su experiencia en la gestación de un proyecto, las estrategias de comunicación y difusión (haciendo especial hincapié en su experiencia a través de las redes sociales) y las posibilidades que ofrecen las plataformas de financiamiento colectivo. La charla permitió comentar brevemente a los oradores sobre cada uno de los proyectos de TECNOx y recibir una devolución muy provechosa sobre varios puntos a tener en cuenta durante el desarrollo de los mismos. Nos fuimos con muchas ganas de poner en marcha en nuestro proyecto todo lo aprendido.

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Semana del 22/12
Esta semana fue corta por los feriados de Navidad. Sin embargo, eso no nos detuvo y seguimos trabajando. Definimos cómo debía ser la construcción de los plásmidos y pedimos un presupuesto para saber cuánto van a costar. Por otro lado, en cuanto al diseño in sílico de los toehold switches, discutimos sobre las características que tienen que tener los aminoácidos que son codificados en el linker. Evaluamos la hidrofobicidad e hidrofilicidad que deben tener los aminoácidos para que no interfieran con la estructura de la GFP y además, la frecuencia de uso de los codones en E. coli.

Semana del 29/12
Esta semana, al igual que la anterior fue corta, pero aun así la aprovechamos para diseñar todos los switches para ureD y espK y sobre todo para analizar su estructura secundaria en presencia y ausencia del ARNm target, la presencia de codones stop entre el AUG y la GFP y la frecuencia de los mismos. Además definimos los sitios de restricción que llevaría cada toehold switch. Por otro lado, terminamos el diseño del logo de TECNOxFFyB y de Colifinders

Enero

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Semana del 4/1
El año lo empezamos haciendo un extremado análisis de los switches diseñados y finalmente haciendo una preselección de los mismos. Analizamos una biblioteca con alrededor de 150 candidatos a toehold switch entre las dos secuencias a diseñar. Por otro lado, diseñamos las secuencia y la estructura de los ARNm blanco que van a activar los switches.

Semana del 11/1
¡ÉXITO! Hemos hallado las secuencias de ARN que cumplen con los requisitos estructurales de nuestros toehold switches! Nos preparamos para mandar a sintetizar las construcciones genéticas y comienza a vislumbrarse el camino para nuestros experimentos de mesada. Además, armamos las recompensas para nuestros colaboradores de Ideame a quienes les debemos gran parte de este proyecto. Durante el fin de semana finalizó nuestra campaña en Ideame, mediante la cual pudimos recaudar nada menos que ¡$11750! Estamos muy contentos y agradecidos a todos los que ayudaron.

Semana del 18/1
Hora de empezar con las tareas de mesada. Esta semana nos encargamos de preparar bacterias competentes para tenerlas listas en cuanto lleguen los plásmidos con los switches y los ARNm blanco, cuyo diseño discutimos esta semana.

Semana del 25/1
Terminamos de diseñar las construcciones de los plásmidos que van a expresar los toehold switches y los ARNm blanco. Además comenzamos la planificación de los experimentos que debemos realizar antes de que lleguen los plásmidos y, por supuesto , de los que vamos a realizar con los switches.


Febrero

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Semana del 1/2
Febrero lo empezamos con inconvenientes experimentales y financieros. Por un lado nos enteramos que la fundación que nos ayudaba económicamente no podía pagar los plásmidos que necesitamos para expresar los toehold switches y los ARNm blanco. Por lo tanto, tuvimos que repensar lo realizado e implementar una estrategia diferente a la que habíamos planteado originalmente. Considerando los costos y los tiempos con los que contamos decidimos evaluar la eficiencia de uno de los dos toehold switches diseñados. De esta forma, una vez confirmado su buen funcionamiento, evaluaremos el otro switch y luego el sistema completo. Este enfoque nos pareció más razonable puesto que se evaluaría una variable a la vez y una vez determinado su eficacia se procedería a evaluar todo el sistema. Por otro lado, al hacer el control de las competentes que habíamos realizado y no obtuvimos buenos resultados. Sin embargo, no todo fueron malas noticias, puesto que a su vez realizamos un experimento para medir fluorescencia de una proteína fluorescente amarilla expresada en bacterias para evaluar el protocolo de medición de fluorescencia en células enteras, obteniendo resultados positivos.

Semana del 8/2
Esta semana trabajamos mucho en pensar una estrategia para expresar el toehold switch. Elegimos evaluar primero el switch que detecta el ARNm de ureD y debatimos en qué plásmido expresarlo. Luego de pensar en lo que teníamos disponible y en lo que se encontraba en el catálogo de iGEM, decidimos usar un plásmido de las partes de iGEM que contaba con un promotor constitutivo fuerte y con una secuencia que codifica para la proteína fluorescente roja (ver más información en Partes). Por otro lado, recibimos la buena noticia de que nos habían transferido la plata que recaudamos mediante nuestra campaña en Ideame, de modo que ya contábamos con medios propios para pedir lo que necesitábamos.

Semana del 15/2
Continuamos discutiendo con más detalle la estrategia para clonar el toehold switch y finalmente diseñamos y encargamos los primers que necesitamos. A su vez, comenzamos a pensar diferentes estrategias para clonar el ARNm blanco.

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Semana del 22/2
Luego de varios contratiempos concluimos por clonar la molécula blanco en un plásmido que tenemos disponible en la facultad, el pET-9b (ver más información en ARNm blanco). Así que diseñamos y encargamos los oligonucleótidos que precisamos. Además fuimos a buscar la parte de iGEM que necesitamos a Ciudad Universitaria, ya que el grupo de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales contaba con el kit y amablemente nos la dieron.

Semana del 29/2
Comienzó el último mes de la competencia y nos pusimos a hacer trabajo de mesada intenso. Preparamos bacterias competentes nuevas, las transformamos bacterias con el pET-9b y con la parte de iGEM, hicimos minipreparaciones para obtener los plásmidos purificados y digerimos el pET-9b con las enzimas de restricción apropiadas para ligar la secuencia que codifica para el ARNm balnco. Y para cerrar la semana ¡llegaron los primers y los oligonucleótidos que encargamos!


Marzo

Semana del 7/3
Empezaron las clases y también los trabajos de mesada de manera intensiva. Preparamos la molécula trigger y la ligamos al plásmido para expresarla. A su vez, volvimos a transformar bacterias con la parte que necesitamos sin obtener los resultados esperados. Por este motivo tuvimos una larga reunión discutiendo las posibles causas que explican los resultados obtenidos y cuáles iban a ser los pasos a seguir.

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Semana del 14/3
Luego del debate de la reunión anterior y de hablar con otros participantes, decidimos transformar nuevamente bacterias pero con la proteína señal (mRFP1, parte BBa_E1010) que nos prestaron los chicos de la UADE. Finalmente logramos obtener transformantes y las colonias rojas que tanto esperábamos. A partir de ellas pudimos largar cultivos en medio líquido para obtener el plásmido y hacer la PCR para agregar el toehold switch. Además, pudimos hacer el ensayo de expresión en la que obtuvimos un pico de fluorescencia a la longitud de onda descripta. Sin embargo, no todo fueran buenas noticias ya que la transformaciones de bacterias con el producto de ligación de la molécula trigger al plásmido no resultó muy eficiente.

Semana del 21/3
Esta semana la tuvimos cargada de mucho trabajo. Desde la parte experimental comenzamos con las PCR para obtener la secuencia promotor-switch-mRFP1. Debimos hacer varias repeticiones de la reacción hasta que finalmente encontramos las condiciones óptimas de amplificación. De esta manera pudimos realizar tres de las 4 PCR programadas. A su vez, volvimos a repetir la transformación de bacterias con el producto de ligación de la molécula trigger sin obtener una buena eficiencia otra vez.
Además, estuvimos trabajando arduamente en la wiki del equipo, agregando información del proyecto, resultados e imágenes.

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Semana del 28/3
¡¡Últimos días!! Comenzamos la semana el domingo para conseguir los últimos resultados. A su vez dedicamos mucho tiempo a terminar nuestra wiki, perfeccionando los detalle finales. Comunicar nuestro trabajo es una parte fundamental de nuestro proyecto y por eso esperamos con ansias el momento de compartirlo con nuestros compañeros de TECNOx Latinoamérica.



Perspectivas a futuro en el corto plazo

Continuaremos con los experimentos para terminar de obtener las secuencias codificantes del toehold switch y del trigger.

Secuencias: Finalizadas las PCRs, avanzaremos con la ligación de los productos de toehold switch en el plásmido pGEM-T y enviaremos 10 clones a secuenciar para conocer exactamente las secuencias nucleotídicas obtenidas. Además enviaremos a secuenciar 5 clones del trigger ligado al plásmido pET9.
Ensayos: Cotransformaremos bacterias de la cepa E coli BL21 DE3 con ambos plásmidos. Además transformaremos la misma cepa con cada uno por separado como experimento control. Se llevará adelante la evaluación del reconocimiento del ARNm (codificado por el trigger) por el toehold switch a través de la medición de la fluorescencia de la proteína roja fluorescente como se describe la sección Expresión toehold switch.


Perspectivas a futuro en el largo plazo

Financiamiento: Para seguir adelante, será muy importante obtener nuevas fuentes de financiamiento. Ya estamos pensando nuevas estrategias.
Objetivos específicos: Queremos encarar, en primera instancia, la puesta a punto del segundo toehold switch propuesto por nuestro grupo y, posteriormente, poner a punto la estrategia de detección de ambos ARNs mensajeros en forma simultánea (estrategia AND basada en fragmentos proteicos que complementan interaccionando no covalentemente).
Avanzaremos con las estrategias de empaquetamiento de ADN y del ensamblado de las partículas virales.
Estudiaremos el desarrollo de un fluorómetro sencillo y de bajo costo con el objetivo de que los planos de construcción del mismo puedan distribuirse libremente entre los laboratorios interesados.
Buscaremos relacionarnos más eficientemente con otros grupos de investigación interesandos en nuestra porpuesta para poder llevarla adelante en tiempos razonables.
Fortaleceremos colaboraciones con grupos de investigación que estén trabajando actualmente con bacterias enterohemorrágicas para que se lleven adelante pruebas de detección de estos microorganismos patógenos.



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