Proyecto

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Objetivo General

Desarrollar un kit rápido, de operación sencilla y de bajo costo, para la detección de bacterias patógenas utilizando un sistema modelo. A través del uso de reguladores traduccionales (toehold switches) vehiculizados por un virus bacteriófago, se obtendrá alta especificidad y sensibilidad en la detección de las siete cepas de Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH) más prevalentes.

Figura 1. Esquema general del sistema de detección de ECEH. El sistema se basa en la detección simultánea de dos ARNm de ECEH (ARNm I y ARNm II) mediante el uso de dos moléculas de toehold switch que, al interaccionar con los ARNm blanco, cambian su conformación y permiten la generación de dos fragmentos proteicos que al complementarse emiten una señal fluorescente que podrá detectarse por medios espectroscópicos convencionales.


Objetivos Específicos

Diseño y caracterización in vitro de la bacteria modelo:

  • Búsqueda y selección de genes específicos de E. coli enterohemorrágica para ser utilizados como marcadores moleculares.
  • Expresión inducible de los ARNm blanco en la bacteria modelo.
  • Evaluación de la expresión de los ARNm blanco.

Diseño de los toehold switches

  • Diseño computacional de dos secuencias de ARN toehold switches que detecten las respectivas moléculas de ARNm blanco, contemplando interacciones, estructura secundaria y estabilidad.
  • Obtención de un plásmido que permita expresar los toehold switches.
  • Detección de los toehold switches en la bacteria modelo.

Verificación del circuito “AND” entre los toehold switches y los ARNm blanco:

  • Modelado de la interacción entre los toehold switches y las secuencias de ARNm blanco.
  • Expresión simultánea de los ARNm blanco y los toehold switches en la bacteria modelo.
  • Análisis de la señal resultante de la complementación de los dos fragmentos proteicos expresados correspondientes a una proteína fluorescente como consecuencia de la interacción de cada uno de los toehold switches con sus respectivos ARNm blanco.

Obtención del vector viral:

  • Diseño del material genético codificante para los dos toehold switches que serán transportados por el bacteriófago hacia el interior de la bacteria patógena.
  • Producción y empaquetamiento del material genético diseñado dentro del bacteriófago.
  • Determinación por métodos espectroscópicos convencionales de la señal producida en las bacterias infectadas por los bacteriófagos

Validación del sistema de detección:

  • Evaluación del desempeño del sistema frente a aislamientos clínicos y muestras de pacientes analizadas previamente en un centro de referencia.
  • Realización de pruebas estadísticas para determinar el índice de especificidad y sensibilidad del sistema.
  • Determinación de la estabilidad de los componentes que conforman el kit.

Transferencia:

  • Difusión de los resultados obtenidos a la comunidad toda.
  • Fomentar la implementación de la biología sintética en Argentina como herramienta para resolver problemáticas sociales.
  • Promover el desarrollo de un kit a escala industrial para su implementación en la región.




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