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Fundamento

La presencia de una combinación específica de genes en una determinada cepa permite su identificación. En particular, la detección de los ARNm (ARNm blanco) de los genes ureD y espK en una misma bacteria confirma la presencia de alguna de las siete cepas de Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH) de mayor prevalencia, con un nivel de confianza mayor al 99 % (Delannoy y col., 2013).

En este proyecto se plantea un sistema de detección específico de ambas secuencias haciendo uso de riborreguladores de la expresión proteica: toehold switches. Se trata de reguladores traduccionales que se activan específicamente por complementariedad de secuencia con un ARNm blanco, generando posteriormente señales medibles. En su estado inactivo (Figura 1A), cada toehold switch presenta una estructura secundaria que impide la traducción por mantener secuestradas dos secuencias necesarias para este proceso: el sitio de unión a ribosoma (RBS) y el codón de iniciación (AUG). Al interaccionar con el ARNm blanco (Figura 1B), el toehold switch cambia su conformación exponiendo dichas secuencias, lo que permite la producción de la proteína que puede ser posteriormente detectada (Green y col. 2014).


Figura 1. Funcionamiento del toehold switch (ver texto).


Para la detección de ECEH se propone utilizar dos toehold switches específicos para los ARN mensajeros de los genes ureD y espK (moléculas blanco). Como consecuencia de la unión de los reguladores con sus respectivos blancos (ambos de manera independiente), se producirán dos fragmentos proteicos complementarios (dos fragmentos de la proteína fluorescente verde GFP). Únicamente, como resultado de la interacción de ambos fragmentos se estabilizará la conformación tridimensional necesaria para la emisión de la señal (Figura 2).


Figura 2. Conformación del circuito AND. Sólo sí ambos ARNm blancos se encuentran simultáneamente en la bacteria, se obtendrá la señal: fluorescencia producida por la complementación de fragmentos proteicos GFPab y GFPcd constituyendo a una variante de la proteína fluorescente verde (GFP).


La utilización  de un circuito AND permite obtener especificidad en la detección, dado que sólo si la bacteria infectada por el bacteriófago cuenta con una transcripción activa de los dos genes disparadores (blanco), se pondrá en evidencia la señal.

Para vehiculizar el toehold switch hacia el interior de las bacterias blanco, utilizaremos bacteriófagos, dado que estos ya se encuentran descriptos para el análisis de patógenos alimentarios (Kim y col. 2014). Los bacteriófagos son virus de bacterias, a algunos de ellos se los conoce desde hace muchos años y son utilizados en Biología Molecular, y se los ha propuesto como herramientas de diagnóstico (Schmelcher y col. 2014, Schofield y col. 2012). Al infectar a una bacteria, el bacteriófago diseñado introducirá su material genético dentro de ella, incluyendo las secuencias de ambos toehold switches bajo la regulación de un promotor constitutivo. De esta forma, los dos toehold switches (ARNs) serán producidos y estarán disponibles para reconocer sus ARNm blanco si estuvieran presentes.



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