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Historia de la glándula pineal​

La melatonina (MT) o N-acetil-5-metoxitriptamina es una hormona producida principalmente en la glándula pineal a partir del triptófano y secretada a la sangre y líquido cefalorraquídeo. A la melatonina se le atribuyen, entre otras, funciones neurohormonales incluyendo la regulación del ritmo circadiano, convirtiendo la señal de un ciclo externo (luz-oscuridad) en una señal que el cerebro pueda comprender.[1]

Tiene importantes propiedades antioxidantes, inmunomoduladoras, hematológicas, gastrointestinales, renales, anticonvulsivantes y otras aún poco esclarecidas. La glándula pineal se encuentra situada sobre el tercer ventrículo cerebral, por encima de los tubérculos cuadrigéminos del mesencéfalo. Presenta forma cónica y se encuentra unida al diencéfalo por el tallo pineal [2] (Ver Figura 1).
Figura 1. Esquema del cerebro humano, ilustrando la ubicación de la glándula pineal.
Presenta uno de los tejidos corporales con mayor flujo sanguíneo en relación a su peso [3]. Está inervada por fibras simpáticas postganglionares de origen periférico, procedentes del ganglio cervical superior como sugirió el premio Nobel de Medicina Santiago Ramón y Cajal en 1904 [4], cuyo neurotransmisor es la noradrenalina. También tiene inervación serotoninérgica, y se ha descubierto que las fluctuaciones de campos electromagnéticos pueden modular su función en mamíferos afectando esto a la síntesis de melatonina, confirmando un posible rol fisiológico de esta glándula frente a las variaciones del campo magnético terrestre [5]. La glándula pineal se conoce desde hace más de 2000 años, la primera descripción se atribuye a Herófilo de Alejandría, en el siglo III a.C. quien la vinculó a funciones de control del “flujo del pensamiento”. Posteriormente Galeno, en el siglo II d.C., la llamó conarium (cono de piña) al describir su anatomía. En 1543, Andrés Vesalio aportó una descripción anatómica precisa de la glándula pineal en su obra De Humanis Corporis Fabrica y unos años más tarde René Descartes en su libro De Homine calificó a la pineal como el lugar donde reside el alma y que era responsable de la correcta comunicación entre la máquina humana y su entorno. Sin embargo, la glándula pineal pasó por un por momento histórico de absoluto olvido científico, en el que se estimó como un mero vestigio rudimentario. En el siglo XIX, el Dictionnaire des Sciences Médicales publicado en 1829 por Antoine Jacques Louis Jourdan, dice acerca de la glándula pineal: “con respecto a la función del órgano pineal, nada es asumible de la ficción de Descartes, concebida en un momento de abuso del racionalismo y de la imperfección de las ciencias naturales”. En 1816, el profesor de anatomía y fisiología de la Universidad de Heidelberg, Friedrich Tiedemann, realizó un estudio embriológico de la glándula pineal, pero sería el seguidor de esta corriente evolucionista, Ludwig Stieda, director del Instituto de Anatomía de Königsberg, quien describió por primera vez una mancha pálida en la región frontal de la cabeza de las ranas, a la que llamó “stirnfleck”. Stieda descubrió que esta mancha estaba integrada por una pequeña, sólida y redondeada masa de células, pero no logró interpretar su significado funcional. En 1868, Franz von Leydig describió detalladamente la glándula parietal de las ranas descubierta por Stieda. Finalmente, sería Alexander Goette quien, en 1872, la relaciona filogenéticamente con la glándula pineal [6]. De esta forma, se inició el estudio de la glándula pineal desde el punto de vista anatómico, embriológico e histológico y se indaga si pudiera tener funciones endocrinas. Esto se confirmó cuando Otto Heubner publicó en 1898 un artículo acerca de tumores pineales [7]. Durante el siglo XX se fueron conociendo en mayor profundidad las funciones de la glándula pineal. Los médicos Altschule y Kitay, de la Universidad de Harvard, descubrieron que la pinealectomía acelera el crecimiento de los ovarios en ratas, mientras que administración de extracto bovino pineal tenía el efecto contrario [8].
Figura 2. Aaron B. Lerner (1920-2007) en una fotografía de 1971. El equipo de Lerner, fue el responsable del aislamiento de la melatonina (Imagen tomada de la U.S. National Library of Medicine, History of Medicine Division).
Estos autores, haciendo una revisión de la bibliografía existente hasta el momento, publicaron en 1954 el libro The pineal gland, donde concluyeron que las tres funciones probables del órgano pineal eran: el control de la función gonadal, la participación en la respuesta cromática de la piel en los vertebrados inferiores a los cambios de la luz ambiental y un vínculo con los trastornos del comportamiento. Pero sin duda el gran paso en el conocimiento de la glándula pineal fue el aislamiento del factor endocrino responsable de su actividad funcional. En 1917, los médicos McCord y Allen vieron que la glándula pineal contiene un compuesto capaz de aclarar la piel de los renacuajos [9]. Basándose en este estudio, en 1958, el dermatólogo norteamericano Aaron Lerner (Ver Figura 2) , de la Universidad de Yale, en un intento de encontrar un tratamiento para el vitíligo identificó, a partir del procesamiento de 250.000 glándulas pineales bovinas de las cuales extrajo apenas unos 100 µg de una indolamina, la estructura química de dicho compuesto como N-acetil-5-metoxitriptamina (fórmula C13H16N2O2 y peso molecular 232,278 g/mol, ver Figura 3) y la llamó melatonina (del griego melas, negro u oscuro). Le dio este nombre al relacionar por un lado su función con el pigmento melanina, ya que era capaz de aclarar las células que producían melanina, y por otro lado su estructura con la serotonina [10]. Aunque no funcionó en los pacientes con vitíligo como Lerner pretendía, este descubrimiento fue el paso más importante en la historia de la investigación pineal, debido a que permitió demostrar que una sustancia química, sintetizada en la glándula pineal exhibía una función endocrina. Durante los siguientes años, varios autores, fundamentalmente de los grupos de Julius Axelrod, del Departamento de Farmacología Clínica del National Institutes of Health, y de Virginia M. Fiske, del Wellesley College, demostraron que la síntesis de la melatonina en la principal célula del órgano pineal, el pinealocito, era regulada en los mamíferos por la luz ambiental a través de una vía neural que, desde la retina, terminaba en las neuronas simpáticas del ganglio cervical superior, y que se trataba de un derivado de la serotonina, una indolamina distribuida por todo el organismo, incluido el cerebro [11]. La naturaleza neuroendocrina de la glándula pineal quedó definitivamente contrastada en 1965, merced a la publicación de dos trabajos científicos de gran trascendencia en este campo. Por un lado, Roger A. Hoffman y Russel J. Reiter, del Laboratorio de Investigación Médica de Edgewood Arsenal (Maryland), demostraron que los cambios gonadales en roedores expuestos a condiciones de oscuridad desaparecen totalmente después de efectuar una pinealectomía, mientras que Axelrod y su entonces colega del National Institutes of Health, Richard J. Wurtman, posteriormente director durante 20 años del Centro de Investigación Clínica del Massachusetts Institute of Technology, introdujeron el término ‘transductor neuroendocrino’ para referirse a la glándula pineal. Con este concepto, los mencionados autores intentaron explicar el principio de la fisiología pineal, esto es, la transformación de la información luminosa externa que alcanza la glándula desde la retina, a través de un circuito nervioso, en una respuesta endocrina, consistente en la síntesis y liberación de la hormona melatonina que, a su vez, actuaría como un potente neurotransmisor en el sistema nervioso central, haciendo del órgano pineal una especie de reloj biológico. En este trabajo, publicado en la revista Scientific American, Axelrod y Wurtman propusieron su ‘hipótesis de la melatonina’, destacando que, en respuesta a los cambios lumínicos del entorno, la glándula pineal no sólo secretaría su hormona, sino que ésta también era capaz de modificar las funciones reproductivas en los mamíferos. Se vio que el mediador químico de estas señales nerviosas era la noradrenalina. Los grandes aportes de Axelrod le hicieron merecedor del premio Nobel de Medicina y Fisiología, que le fue otorgado en el año 1970 [12] [13].
Figura 3. Fórmula semidesarrollada de la molécula de melatonina.

Finalmente, en 1975, se descubrió que la secreción de melatonina en humanos, tal como años atrás se había visto en animales, seguía un ritmo circadiano, con concentraciones nocturnas al menos 10 veces más elevadas que las diurnas [14]. En los últimos años, numerosos estudios han permitido conocer mejor las distintas funciones y mecanismos de acción de la melatonina siendo actualmente la investigación en este terreno muy amplia no sólo en la disciplina médica sino en el campo de la biología, fisiología, etc. De hecho, a principios de la década de los setenta, se demostró la existencia de un oscilador circadiano situado en el núcleo supraquiasmático del hipotálamo, que controlaría la síntesis de melatonina en el órgano pineal en función de la actividad de una enzima en particular [15]. Así, en condiciones de integridad del mencionado circuito neuronal, la melatonina exhibe un típico patrón rítmico de síntesis y secreción de forma que, durante el día, las concentraciones plasmáticas de la hormona son bajas (10-20 pg/mL), mientras que durante la noche experimentan un incremento significativo (80-120 pg/mL), con un marcado pico entre las 24 y las 3 horas. Por tanto, la glándula pineal forma parte, a modo de engranaje de trascendental importancia, del ‘reloj biológico’ responsable de adecuar los ritmos biológicos a los cambios periódicos del ambiente.La identificación de las dianas biológicas sobre las que la melatonina ejerce sus acciones fisiológicas constituyó uno de los siguientes pasos de investigación. A finales de la década de los setenta, el grupo del doctor Daniel O. Cardinali, de la Universidad de Buenos Aires (Argentina), identificó los receptores específicos de la melatonina en cerebro bovino, utilizando [3H]melatonina, y unos años más tarde, los perfiles farmacológicos de estos receptores se caracterizan definitivamente, gracias al uso del radioligando 2-[125I]iodomelatonina, un agonista de alta afinidad de éstos, por parte del grupo de Margarita L. Dubocovich, de la Northwestern University Medical School [16]. Hasta el momento, han sido clonados tres subtipos de receptores de melatonina en los mamíferos, de los cuales los denominados MT1 y MT2 (previamente denominados Mel1a o MTNR1A y Mel1b o MTNR1B, respectivamente), son de alta afinidad, mientras el MT3 es de baja afinidad. Estos receptores de la melatonina pertenecen a un grupo diferenciado de la superfamilia de receptores metabotrópicos acoplados a proteína G (GPCR). El paso final en el desarrollo de este proceso de consolidación de la pinealogía como disciplina científica fue el lanzamiento, en 1984, de una publicación periódica dedicada específicamente a este campo, el Journal of Pineal Research.

Síntesis, metabolismo y regulación de la melatonina

La melatonina es una molécula de al menos 2 mil millones de años, que está presente en animales, tanto vertebrados como invertebrados, plantas, bacterias, hongos y organismos unicelulares, lo que indica que es una molécula conservada en la evolución y que ha ido adoptando múltiples funciones adicionales. Se cree que por su potente efecto antioxidante,
Figura 4. Síntesis bioquímica de melatonina en el organismo humano.
apareció con la misión de neutralizar el efecto dañino del oxígeno como productor de radicales libres. Con el transcurso de la evolución ha ido adquiriendo otras funciones hormonales. La síntesis de melatonina tiene lugar fundamentalmente en la glándula pineal pero también en otros tejidos como retina, cuerpo ciliado del iris, glándula lacrimal, médula ósea, aparato digestivo, ovario, sistema inmune y sistema hepático. La concentración de melatonina en los tejidos es mucho mayor que la del plasma [17]. En la glándula pineal, la melatonina se sintetiza a partir de triptófano, un aminoácido esencial. Ingresa al pinealocito desde los capilares sanguíneos a través de un transporte activo bajo control adrenérgico y, a través de la enzima triptófanohidroxilasa, pasa a 5-hidroxitriptófano. Posteriormente, se descarboxila por la L-triptófanodescarboxilasa para formar 5-hidroxitriptamina o serotonina. La serotonina tiene dos vías de metabolización en la glándula pineal. Puede desaminarse por la enzima monoaminooxidasa (MAO), o convertirse en melatonina por acción de dos enzimas que actúan sucesivamente. Primero, la N-acetiltransferasa (NAT) que la transforma en N-acetilserotonina y posteriormente, la enzima hidroxiindol-O-metiltransferasa (HIOMT), que le transfiere un grupo metilo para finalmente dar lugar a la N-acetil-5-metoxitriptamina o melatonina (Ver Figura 4) [18].La actividad de la N-acetiltransferasa presenta un marcado ritmo circadiano y determina el ritmo pineal de producción de melatonina [19] [20]. La expresión de la enzima se puede regular por una vía nerviosa controlada por el núcleo supraquiasmático del hipotálamo, el llamado reloj biológico. Esta vía comienza en la retina (Ver Figura 5), de allí se dirige al núcleo supraquiasmático a través de la sección retinohipotalámica y, pasando por la columna intermediolateral de la médula espinal torácica, alcanza el ganglio cervical superior [21]. Finalmente, las fibras postganglionares se introducen en el parénquima pineal y llegan a los pinealocitos. El estímulo lumínico mantiene a los fotorreceptores hiperpolarizados lo que hace que no se libere, al final de esta vía nerviosa, la noradrenalina. Por el contrario, durante la noche los fotorreceptores generan señales conducidas hasta los terminales simpáticos y se libera noradrenalina que se une a receptores α1 y β1 adrenérgicos del pinealocito [22]. Esta unión desencadena una reacción bioquímica intracelular donde el ATP se transforma en cAMP vía adenilato ciclasa, que se traduce en un incremento de la expresión y actividad de la N-acetiltransferasa, con la consecuente elevación de las concentraciones de N-acetilserotonina y, por ende, de melatonina [23]. Al tener una estructura indólica, la melatonina es una molécula bastante liposoluble y tras ser sintetizada atraviesa fácilmente, por difusión simple, la membrana del pinealocito hasta los capilares sanguíneos. La concentración de melatonina en sangre circulante refleja de forma muy exacta los cambios en la concentración de melatonina en la glándula pineal [24] ya que la vida media de la melatonina circulante es inferior a una hora. Se transporta en plasma en su mayor parte, un 65-70%, unida a la albúmina y el resto en forma libre [25].
Figura 5. Mecanismo mediante el cual la información lumínica externa desencadena un respuesta interna responsable del ritmo circadiano.
El ciclo de luz-oscuridad va paralelo al ritmo de la actividad de la N-acetiltransferasa [26] [27] [28]. En el hombre también se ha demostrado que la exposición a la luz durante la noche disminuye la síntesis de melatonina[29]. La secreción de melatonina también se ve influida por los cambios estacionales según la duración del fotoperiodo [30], así en fotoperiodos largos como en verano la secreción es menor, y mayor durante el invierno. El metabolismo de la melatonina tiene lugar en su mayor parte en el hígado vía hidroxilación del carbono ubicado en la posición 6, donde a través del citocromo p450 hepático microsomal CYP1A2, con una menor contribución del citocromo hepático CYP2C19, y los citocromos extrahepáticos CYP1A1 y CYP1B11A, se transforma en 6-hidroximelatonina [31] y tras conjugación con sulfatos o glucurónido es excretada por la orina. Otro importante metabolito es la N-acetilserotonina, que se forma por O-desmetilación. La melatonina también es metabolizada en los tejidos por ruptura oxidativa del anillo pirrólico dando derivados de kynuramina. El producto primario de esta ruptura es N1-acetyl-N2-formil-5-metoxikynuramina (AFMK) que luego es deformilada, por enzimas como la arilaminaformamidasa o hemoperoxidasa, a N1-acetyl-5metoxikynuramina (AMK). Se ha propuesto que AFMK es el metabolito activo primario de la melatonina que media la citoprotección. A su vez, la melatonina es convertida en 3-hidroximelatonina cíclica en un proceso que elimina directamente dos radicales hidroxilo [32].

Mecanismos de acción de la melatonina

La melatonina ejerce sus funciones a través de dos mecanismos de acción diferentes, mediados por unión a receptor, ya sea de membrana o nuclear y de forma independiente del receptor. El desarrollo de la 2-[125I]iodomelatonina, un agonista del receptor de melatonina de alta afinidad como radioligando, ha permitido examinar la distribución y características de los receptores de la melatonina en varias especies, encontrándose que la melatonina actúa como inhibidor intracelular del cAMP a través de un mecanismo acoplado a proteína G, demostrando que es una vía común de transducción de muchos receptores de melatonina [33].
Figura 6. Sitios de acción de la melatonina en el cuerpo humano.
Los receptores de membrana son receptores proteicos y se pueden dividir a su vez en receptores de alta afinidad (MT1 y MT2) y receptores de baja afinidad (MT3). Los receptores MT1 y MT2 corresponden a la familia de receptores de 7 dominios transmembrana acoplados a proteína G, actuando a través de un mecanismo de transducción de señales. Ejercen su acción mediante la inhibición de la adenilato ciclasa, lo que conlleva una disminución de cAMP intracelular, y activación de fosfolipasa C. Los receptores MT1 se expresan en cerebro, fundamentalmente en el núcleo supraquiasmático [34]. Los MT2 se encuentran en la retina y otras estructuras cerebrales [35]. Los receptores nucleares son proteínas que se encuentran en el interior del núcleo, capaces de unirse a la región reguladora de algunos genes. Estas proteínas, al unirse a su ligando específico se activan, de forma que regulan la actividad de la ARN polimerasa II, necesaria para la transcripción génica. Se han clonado varios receptores nucleares de melatonina y, aunque no se conocen del todo sus funciones en el momento actual, estos receptores suelen estar implicados en la inhibición de la inflamación por la melatonina, ya que al bloquear la síntesis de melatonina vía triptófano, los niveles de interleucinas IL-1 e IL-2 disminuyen [36]. Entre sus mecanismos de acción de forma independiente de receptor estarían la unión de la melatonina con proteínas intracelulares como calmodulina, calreticulina y la proteína quinasa C, y su acción como detoxificadora de radicales libres (Ver Figura 6).

Funciones de la melatonina

La melatonina es una hormona con gran diversidad funcional. Posee numerosas funciones, entre ellas son bien conocidas su relación con el sistema neuroendocrino y reproductor y la regulación de los ritmos biológicos, así como su función antioxidante y citoprotectora. Además, existe evidencia sobre su implicación en numerosas funciones como por ejemplo antiinflamatoria, potenciadora del sistema inmune, inhibidor de la progresión tumoral, analgésica, moduladora mitocondrial, etc. Generalmente los efectos de la melatonina en ritmos biológicos se encuentra a escala nanomolar y está mediada por mecanismos vía receptores, mientras que los efectos citoprotectores requieren concentraciones 100 a 1000 veces superiores.

Función antioxidante

El metabolismo basado en oxígeno confiere un coste para los organismos, siendo el oxígeno indispensable para la vida de los organismos aeróbicos, constituye una fuente de daño para los mismos. Ello es debido a que como resultado de la utilización del oxígeno en el organismo, se generan productos altamente tóxicos y dañinos llamados radicales libres. Un radical libre se define como una especie química, en general altamente inestable, y por tanto con gran poder reactivo. Los radicales libres confieren daño a macromoléculas del organismo como el ADN, lípidos y proteínas. Para contrarrestar esta producción de radicales libres el organismo dispone de un sistema de defensa antioxidante que utiliza multitud de compuestos endógenos y exógenos. Pero este sistema no es perfecto y no siempre consigue neutralizar estos radicales libres, lo que genera un daño oxidativo en el organismo, estando este en relación directa con el proceso del envejecimiento y con el cáncer [37]. Un mecanismo de acción de la melatonina, independiente de la interacción con receptores o con proteínas celulares, es su interacción con radicales libres protegiendo al ADN, las proteínas y los lípidos del daño oxidativo. Es capaz de neutralizar los oxidantes más tóxicos generados por la célula como especies especies radicalarias de oxígeno (ROS) y de nitrógeno (RNS). Además de la melatonina, numerosos metabolitos que se forman cuando ésta interacciona con los radicales libres, constituyen también efectivos antioxidantes [38]. El primero de estos metabolitos en ser descubierto fue la 3-hidroximelatonina cíclica, potente depurador de radicales libres y que en el camino se transforma en N1-acetil-N2-formil-5-metoxikynuramina (AFMK). Este último también resulta de la reacción de la melatonina con el peróxido de hidrógeno y es un efectivo antioxidante que en su interacción con los radicales libres genera N1-acetil-5-metoxikynuramina (AMK). Ello hace que la melatonina sea altamente eficiente en reducir el daño oxidativo y que pueda describirse una “cascada antioxidante de la melatonina”. Además de su acción antioxidante directa posee efectos indirectos ya que estimula la actividad y expresión de enzimas antioxidantes como la superóxido dismutasa, glutatión catalasa, glutatión peroxidasa y glutatión reductasa [39] [40]. La melatonina incluso ha demostrado superioridad respecto a las vitaminas C y E en la protección contra el daño oxidativo causado por los radicales libres. Actúa también indirectamente en la promoción de la expresión génica de enzimas antioxidantes e inhibe la expresión génica de enzimas pro-oxidantes.

Regulación de los ritmos biológicos y el sueño

La glándula pineal mediante la melatonina, su principal producto de secreción, constituye el mediador de la respuesta fisiológica a los ritmos anuales y circadianos. Actúa como nexo de unión entre los sistemas nervioso y endocrino y el medio ambiente luminoso. La secreción de melatonina sigue un marcado ritmo circadiano que se rige por el marcapasos circadiano central (reloj biológico) en el núcleo supraquiasmático del hipotálamo. Uno de los usos iniciales de la melatonina en el hombre fue como tratamiento del jet lag tras los viajes transatlánticos. Como consecuencia de resultados como este, la melatonina ha sido clasificada como un cronobiótico, ya que un gran número de publicaciones han mostrado que la administración de melatonina exógena produce somnolencia, adelantando el inicio del sueño [41]. La melatonina señala la hora del día y época del año en los mamíferos en función de su patrón de secreción. El ritmo de melatonina (como lo demuestra su perfil en plasma (Ver Figura 7), saliva o de su principal metabolito (6-sulfatoxymelatonina, en orina) es el mejor índice periférico de la sincronización del marcapasos circadiano humano [42] [43]. Un signo evidente de la alteración del ritmo circadiano es la mala calidad del sueño, constituyendo entonces la melatonina un eficaz tratamiento para estos trastornos.
Figura 7. Niveles de melatonina en plasma sanguíneo durante un ciclo día-noche en el ser humano. Puede verse que la cantidad de melatonina secretada depende de la duración del período nocturno.

Regulación de la reproducción y la maduración sexual

Hace más de un siglo se estableció la relación entre la glándula pineal y el desarrollo sexual. En circunstancias naturales, la duración del pico nocturno de melatonina es inversamente proporcional a las horas de exposición a la luz. Por tanto en verano los picos de melatonina duran menos que en el invierno. Estos cambios estacionales en los patrones de secreción de melatonina proporcionan información al organismo sobre cada época del año y constituyen una señal esencial para las fluctuaciones anuales de la capacidad reproductora de los animales. Esto se produce con independencia de si el animal es activo desde el punto de vista reproductivo en el verano o en el invierno, es decir, la melatonina no es ni antigonadotrópica ni progonadotrópica, simplemente envía una señal al organismo que se interpreta de una manera u otra dependiendo de la especie. En aquellas especies que tienen ciclos anuales de fertilidad e infertilidad la melatonina tiene una función reguladora del ciclo reproductor lo que garantiza que las crías nazcan en la época del año más favorable para su supervivencia. En el ser humano se ha propuesto que la melatonina es la hormona que a elevadas concentraciones mantiene inhibido el generador hipotalámico de pulsos de GnRH, la hormona liberadora de gonadotrofina y su descenso en el periodo prepuberal facilita la aparición de la misma [44].

Inmunomodulación

En los últimos años, el efecto inmunomodulador de la melatonina ha suscitado un gran interés. En 1986, se demostró que la inhibición de la síntesis de melatonina provoca la inhibición de respuestas celulares y humorales en ratones y esto se revertía con la administración de melatonina [45]. Posteriormente numerosos estudios han demostrado la relación entre la melatonina y el sistema inmunológico. Un gran número de estudios apoyan la acción inmunomoduladora de la melatonina en la inmunidad innata. La melatonina se produce en los leucocitos incluidos los monocitos, eosinófilos, mastocitos, linfocitos T, células Natural Killer (NK) y en las células de la médula ósea. Los leucocitos poseen receptores de membrana (MT1 y MT2) y receptores nucleares para la melatonina. La melatonina estimula la producción de células progenitoras de granulocitos y macrófagos. Se ha observado que la melatonina exógena aumenta las células NK y los monocitos tanto en bazo como en la médula ósea. Además de los monocitos, también los precursores de granulocitos aumentan en médula ósea tras administración de melatonina. Se han aislado receptores de membrana para melatonina en los Linfocitos B y los Linfocitos T y se ha visto que sintetizan cantidades importantes de melatonina. La melatonina también regula el sistema inmune a través de las citoquinas. Aumenta la producción de citoquinas por los monocitos, entre ellas la interleucina IL-12 que favorece la diferenciación de los Linfocitos T helper (Th) a Th1 y también aumenta la producción de IFN-gamma por las células Th1 [46]. La melatonina aumenta la producción y la actividad de las células Natural Killer y esto último se atribuye a la mayor producción de IL-2 y de IL-12.
Figura 8. Sitios claves del organismo humano donde la melatonina actúa como inmunomodulador.
También se ha visto que la melatonina aumenta la supervivencia de los linfocitos B maduros participando por tanto en la inmunidad humoral (Ver Figura 8). Aunque la mayoría de estudios catalogan a la melatonina como un potenciador del sistema inmune, otros han sugerido que la melatonina podría actuar como antiinflamatorio por inhibición de la respuesta inmune [47]. Por otro lado, la melatonina al afectar la diferenciación y la función de células T efectoras y regulatorias, representa una señal que contribuye a las recaídas con la estacionalidad de la esclerosis múltiple y es un potencial target para intervenciones terapéuticas en enfermedades mediadas por la respuesta inmune. Los niveles de melatonina se correlacionan negativamente con la actividad de la esclerosis múltiple en humanos, y el tratamiento con melatonina mejora los síntomas de la enfermedad, y que induce la expresión de un represor de un factor de transcripción, bloqueando la diferenciación en células T patogénicas y aumenta la generación de células T protectoras. Se ha encontrado que los niveles de melatonina, que tienen picos en otoño e invierno, tienen correlación inversa con la actividad de la esclerosis múltiple, decreciendo los síntomas en estas estaciones. La gran conservación evolutiva en la producción de melatonina por la glándula pineal, y su regulación diaria, reflejan que el ritmo circadiano y los efectos estacionales de la melatonina sobre la respuesta inmune juegan un rol tan importante que resultó en una selección positiva durante la evolución, al nivel de poder controlar el balance entre las células T patogénicas y regulatorias [48].

Melatonina, cáncer y enfermedades neurodegenerativas

Existe suficiente evidencia que demuestra que la melatonina está implicada en prevenir el inicio y progresión del cáncer. Muchos tumores se desarrollan tras el daño del ADN cuando fallan los mecanismos de reparación y este daño al ADN es debido frecuentemente a los radicales libres. La melatonina neutraliza los radicales libres y protege al ADN del daño oxidativo pero además es capaz de ayudar en su reparación una vez este ha sido dañado [49]. Debido a estas dos acciones la melatonina es capaz de frenar el inicio de la transformación tumoral y por tanto la frecuencia del cáncer. Numerosos estudios han hecho que pueda considerarse a la melatonina como agente oncostático debido a su capacidad de inhibir la progresión tumoral. Debido a la multitud de acciones de la melatonina, los mecanismos involucrados en su capacidad para contrarrestar el crecimiento tumoral son múltiples, entre ellos estarían su capacidad antioxidante, la regulación de la expresión y transactivación del receptor estrogénico, modulación de las enzimas implicadas en la síntesis local de estrógenos, la modulación del ciclo celular y la inducción de la apoptosis de las células tumorales, la inhibición de la actividad de la telomerasa, inhibición de metástasis, efecto antiangiogénico, estimulación de la diferenciación celular y activación del sistema inmune. La melatonina se ha mostrado eficaz como tratamiento en los tumores sólidos con mejoría significativa de la remisión tumoral, supervivencia al año y mitigación de efectos secundarios relacionados con la radioterapia y quimioterapia [50]. También exhibe propiedades neuroprotectoras al proteger a las neuronas de la toxicidad de los péptidos beta-amiloideos a través de la activación de receptores GABA [51].


Variación de la producción de la melatonina en función de la edad

Durante la vida intrauterina, el feto recibe la melatonina de la madre, a través de la placenta la melatonina llega a todos los tejidos del feto y por tanto la melatonina materna conduce a los ritmos circadianos fetales.
Figura 9. Representación esquemática de los niveles de melatonina a lo largo del día y la noche de acuerdo a la edad.
Tras el nacimiento, aunque el núcleo supraquiasmático y la glándula pineal maduran precozmente en la vida fetal, el circuito neurológico que controla dichas estructuras no, por lo que no existe un ritmo circadiano de secreción de melatonina. Se ha observado que el patrón circadiano de secreción de melatonina aparece entre los 2 y los 4 meses de vida estando retrasado en el recién nacido en pretérmino. La secreción de melatonina es baja al nacimiento y se incrementa significativamente en el periodo neonatal precoz (primeras 72 horas de vida), esto se cree que es debido a la inmadurez hepática fisiológica con menor tasa de metabolización. Aunque el ritmo circadiano de secreción de melatonina no existe al nacimiento sí se encontró que esta secreción era sensible a cambios en la iluminación del entorno. Tras el nacimiento, la secreción de melatonina va aumentando de forma progresiva hasta alcanzar un pico máximo entre el año y los 3 años de vida, a partir de este momento la amplitud de los ritmos diarios de melatonina en plasma decrecen alrededor de un 75% entre los 7 y 15 años [52]. Se ha observado que se produce un descenso significativo de la secreción de melatonina, sobre todo durante la noche, en la etapa prepuberal y durante la misma, lo que ha llevado a proponer que la glándula pineal desempeñaría un papel primordial en el inicio de la pubertad que estaría facilitada por este descenso de la secreción de melatonina. Los niveles de melatonina se mantienen estables en el adulto y posteriormente experimentan un nuevo descenso en la vejez (Ver Figura 9) [53].

Alimentos que contienen melatonina

La melatonina ha sido descubierta fuera del Reino Animal por primera vez en un alga dinoflagelada llamada Lingulodinium polyedrum; también ha sido encontrada en protistas, procariotas y recientemente en algunos alimentos, principalmente en los de origen vegetal. Actualmente ha sido propuesta como un nuevo componente bioactivo a ser considerado en las tablas de alimentos que aportan componentes con actividad biológica definida. La ingesta de alimentos ricos en triptófano pueden estimular la síntesis de melatonina, pero también la ingesta de melatonina exógena como componente natural de los alimentos puede contribuir a mejorar síntomas relacionados a deficiencias de esta hormona. Pero las técnicas analíticas para determinar melatonina en alimentos aún no está optimizada, ya que puede encontrarse en bajas cantidades, y es un potente antioxidante por lo que puede reaccionar rápidamente con otros componentes de los alimentos, sumado a su carácter anfipático que dificulta la elección de solventes de extracción adecuados que permitan separar al analito de la matriz con buen rendimiento. El rol de la melatonina en vegetales, acorde a estudios realizados, está vinculado al ritmo circadiano y a la protección frente al estrés oxidativo. Esta hormona ha sido detectada en frutas y semillas comestibles como el arroz y, si bien este último consumido luego de un tratamiento térmico, aún no hay reportes que indiquen destrucción de melatonina por calor. Otras fuentes naturales de melatonina son las frutillas, kiwis, piñas, manzanas y bananas, en rangos que van desde los 12 pg/g a los 36 pg/g. Los vegetales que crecen bajo tierra, al estar protegidos de la luz contienen niveles de melatonina mayores, como es el caso de la zanahoria (55 pg/g) y la cebolla (86 pg/g). Recientemente se ha descubierto melatonina presente en aceite de oliva y vinos tintos, y se han reportado valores que van desde los 1,8 pg/ml a 10,5 pg/ml en leche de vaca. Sin embargo, el uso de melatonina exógena, como por ejemplo en suplementos que permiten corregir trastornos de sueño, incrementa los niveles plasmáticos de melatonina y esto puede interferir con el ritmo circadiano, siendo por este motivo que debe administrarse sólo antes de dormir. Esta consideración limita hasta hora la potencial adición de melatonina a los alimentos [54]. La melatonina es considerada un suplemento dietario, de manera que las regulaciones de la FDA sobre los medicamentos no son aplicables a su comercialización y por ello es de venta libre en países como Estados Unidos y Canadá. Sin embargo, en otros países es considerada una neurohormona y sólo se vende bajo receta médica.

Métodos actuales para la determinación de los niveles de melatonina

La preparación de la muestra depende del método de análisis, pudiendo otros compuestos de la matriz interferir en la señal de melatonina. En muestras de suero, la melatonina puede ser extraída por procedimientos líquido/líquido con diclorometano y cuantificarse luego por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con detector UV seguido de espectrometría de masas (MS) o por cromatografía gaseosa (GC) acoplada a MS derivatizando la muestra previamente. Para monitorear la melatonina en fluidos biológicos, los inmunoensayos son los más empleados. Existen kits disponibles basados en este método que tiene un bajo límite de detección (0,5pg/ml) pero pueden dar reactividad cruzada con otros compuestos similares a la melatonina, si la misma no fue extraída y purificada previamente. El punto más crucial de los inmunoensayos es la preparación del antisuero. Debido a que la melatonina es una molécula relativamente pequeña como para producir antisuero por sí misma, debe ser acoplada a una proteína antigénica. También existen inmunoensayos sensibles a 6-sulfatoximelatonina, su producto de degradación excretado en orina. Por otro lado, puede detectarse melatonina por radioinmunoensayos con 235-iodomelatonina o deuteromelatonina aunque en algunos casos ha sido reemplazada por HPLC con detector de fluorescencia debido a su mayor sensibilidad y especificidad. No obstante, GC-MS ofrece mayor sensibilidad que las anteriores por HPLC, sólo que como desventaja acarrea la derivatización de la muestra. La determinación de melatonina en saliva, por HPLC-MS/MS ofrece bajos límites de detección y recientemente se ha descubierto que el arreglo HPLC-MS/MS-ESI permite detectar cuantitativamente melatonina así como su degradación con gran sensibilidad y especificidad. Para determinar melatonina en plasma sanguíneo algunos laboratorios emplean la electroforesis capilar que ofrece límites de detección similares a los descritos para HPLC [57] [58]. Todos estas estas metodologías analíticas requieren laboratorios especializados que cuenten con el equipamiento necesario y, si bien son de rutina en química analítica, resultan relativamente costosas para ensayos clínicos de rutina.

¿Sabías qué ...?

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En los humanos se necesitan al menos 15 lux (correspondiente a la iluminación de la calle) para que se produzca el bloqueo de la melatonina. Esto significa que la iluminación normal en un hogar (100-200 lux) o la luz intensa que hay en una oficina o una fábrica (mayor a 700 lux) produce una marcada inhibición en la síntesis de melatonina por la glándula pineal, favoreciendo los procesos de insomnio.





Qué, por qué y para quién

La melatonina es una hormona clave en la regulación del ritmo circadiano en los seres humanos. Por esta razón, no es llamativo que la misma esté vinculada a trastornos en el sueño. Analizando el escenario local, en la Argentina hay un 40% de la población que padece trastornos para conciliar el sueño, según los relevamientos realizados por la Asociación Argentina de Medicina del Sueño (AAMS). A nivel mundial la prevalencia global de los trastornos del sueño sigue una tendencia similar. Debido a la complejidad de este tipo de trastornos multifactoriales, es de suma importancia médica la medición adecuada de los niveles de melatonina, principal regulador del sueño. Sin embargo, sin menospreciar su importancia en este sentido, hoy en día se la ha asociado a un gran número de patologías, como son la diabetes, la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades neurológicas. Para más información ver 1.Background. El panorama actual en cuanto al diagnóstico molecular de patologías asociadas a desregulaciones en los niveles fisiológicos de melatonina es pobre y limitado. Hoy en día los especialistas médicos no cuentan con una herramienta de bajo costo y fácil uso para la determinación de los niveles de melatonina en pacientes, lo cual dificulta, sin lugar a dudas, la realización de un diagnóstico adecuado. Es por esta razón que, ahora más que nunca, creemos que el desarrollo de nuevas técnicas que faciliten el estudio de los niveles de melatonina adquiere una gran relevancia. En suma, tenemos la convicción de que Chronosense puede hacer una diferencia en este sentido.

El objetivo del proyecto fue el desarrollo de un dispositivo para la medición de melatonina en fluidos corporales, particularmente en orina y en saliva [57](Ver 3.Implementación de la solución), de bajo costo y, por ende, más accesible que los disponibles actualmente. Esto implica que el nuevo método debería poder llevarse a cabo en cualquier laboratorio, sin demandar instalaciones o equipamientos sofisticados ni reactivos caros como demandan los métodos actuales. Al tener estas características, el mismo permitiría llevar a cabo un control de los niveles de hormona a mayor escala en la población general, habilitando a que un mayor número de personas accedan al dosaje hormonal y permitiendo el control de la hormona con mayor frecuencia. Esto principalmente significa que más cantidad de gente, incluidas personas de bajos recursos, podrían ser diagnosticadas de manera precoz ante cualquier mal funcionamiento asociado a los niveles de hormona. Además, hoy en día con la creciente concientización sobre las posibles repercusiones de alteraciones en esta hormona, muchos equipos de investigación trabajan estudiando la función y la fisiología de la melatonina. Es de interés desarrollar un método que facilite la obtención de información, permitiendo obtener cuerpos de datos más amplios y precisos.

Pero ¿existe un método de medición que reúna las características mencionadas previamente?

Actualmente una nueva rama de la biología está en auge. La biología sintética se basa en la construcción de organismos no existentes por vías naturales, que pueden servir a un fin en particular. Dentro de esta disciplina encontramos el desarrollo de biosensores, mecanismos que involucran organismos artificiales capaces de sensar distintos tipos de moléculas y brindar una respuesta fácilmente observable. Como estandartes de este ámbito se pueden mencionar a The BioBricks Foundation, una plataforma para la construcción de plásmidos fácilmente editables e intercambiables; o la competencia iGEM, que desde el MIT otorga reconocimiento a equipos de estudiantes a nivel internacional. Y ahora TECNOx.

Los microorganismos construidos, modificados de manera tal de dar el output deseado ante un estímulo determinado, requieren únicamente de alimento para crecer y permitir el funcionamiento del mecanismo. Concretamente, para poder utilizar un biosensor, un laboratorio debe contar únicamente con el equipamiento necesario para otorgarle condiciones adecuadas para su conservación y propagación (heladeras, estufas), y el único recurso que efectivamente se consume es el medio de cultivo. Por esta razón, elegimos desarrollar un biosensor de melatonina, ya que consideramos que cumple con las características deseadas.

En este proyecto, se eligió como plataforma a Saccharomyces cerevisiae, un hongo unicelular utilizado por la humanidad desde la antigüedad y que se sigue explotando ampliamente hoy en dia. Es el microorganismo responsable de la fermentación en la producción de pan, cerveza y vino. Debido a su relativa simplicidad, a pesar de ser una célula eucariota, es uno de los organismos más estudiados a nivel celular y molecular. Por esta razón, es un organismo ideal para desarrollar un biosensor, ya que es fácilmente cultivable y posee muchos caminos de señalización celular muy bien comprendidos, de los cuales uno se puede valer para hacer ingeniería genética y biología sintética sobre los mismos. Específicamente, en el este proyecto se busca modificar la vía de respuesta a feromona de S. cerevisiae para que la misma sea capaz de sensar a la hormona humana: la melatonina.

Implementación de la solución

Para comprender el funcionamiento del biosensor primero es necesario tener una idea clara del sistema celular utilizado como base. Por esta razón, primero se describirá la vía de señalización utilizada, y luego se desarrollarán las modificaciones realizadas y el funcionamiento del biosensor.

Vía de señalización de feromonas en Saccharomyces cerevisiae

En el ciclo de vida de Saccharomyces cerevisiae, representado en la Figura 1, se alternan células haploides con células diploides. Durante la fase haploide se pueden distinguir dos tipos celulares, las levaduras mating type a y las levaduras mating type alpha. Cada uno de estos tipos celulares secreta una feromona que es detectada por las levaduras del otro tipo. Es decir, las levaduras tipo a secretan el factor a, detectado por las levaduras tipo alpha, y las levaduras tipo alpha secretan el factor alpha, detectado por las levaduras tipo a [61]. La función de este mecanismo es el reconocimiento de los dos tipos celulares entre sí, con el objetivo de iniciar la fusión de las levaduras haploides y regenerar la célula diploide. Esto se logra como consecuencia de las modificaciones que sufren las células haploides luego de detectar al factor correspondiente, entre las que se incluyen el arresto del ciclo celular y el crecimiento polarizado de las levaduras en dirección de la fuente de feromona, formando una estructura que se conoce como shmoo [61].

Figura 1: Ciclo celular de S. cerevisiae: 1.Brotación, 2.Conjugación, 3.Esporulación

El mecanismo molecular por el que ocurre este proceso es la vía de transducción de señales mediada por proteína G que se esquematiza en la Figura 2. En la misma se representa la vía en las levaduras tipo a (MAT a), que serán las utilizadas en este proyecto.

En primer lugar, el factor alpha es detectado por un GPCR de siete pasos transmembrana: Ste2. La interacción de la feromona con el receptor genera modificaciones estructurales en la región citosólica del mismo, lo que a su vez induce cambios en la proteína G asociada al GPCR [62]. Esta proteína está conformada por tres subunidades, una subunidad alpha (Gpa1) que une GTP/GDP y que es la que interactúa con el receptor y un dímero beta-gamma (Ste4-Ste18). Tanto la subunidad alpha como el dímero están asociados a la membrana plasmática por medio de grupos lipídicos. En el estado inactivo las tres subunidades están juntas y Gpa1 está unida a GDP. La interacción con el receptor activo genera el intercambio de GDP por GTP en Gpa1 lo que a su vez provoca la disociación con el dímero ya que disminuye la afinidad entre las subunidades [63]. El estado descripto anteriormente es el estado activo de la proteína G. Para volver al estado inactivo, la misma Gpa1 tiene actividad GTPasa capaz de hidrolizar al GTP. Luego, Gpa1-GDP vuelve a ser afín por el dímero por lo que se regenera la proteína trimérica inactiva. Si bien Gpa1 tiene actividad GTPasa, la presencia de una proteína activadora de dicha actividad, Sst2, aumenta de manera significativa la tasa en que ocurre la hidrólisis [63 y 64]. Por esta razón, Sst2 constituye uno de los principales mecanismos de apagado de la vía. En el caso de las levaduras, es el dímero Ste4-Ste18 el que continúa con la transducción de la señal y no Gpa1-GTP. Según el conocimiento actual, la función de Gpa1 en la vía de respuesta a la feromona sería principalmente regulatoria, secuestrando e inhibiendo a Ste4-Ste18 cuando está unida a GDP [61].

Figura 2: Camino de señalización de feromonas en levaduras

En su estado activo, el dímero Ste4-Ste18 transmite la señal río abajo al provocar la colocalización de las siguientes enzimas en la vía de transducción. Por un lado Ste4-Ste18 interactúa con Ste5, una proteína de andamiaje de 4 kinasas, Ste11, Ste7, Fus3 y Kss1. En conjunto, estas proteínas conforman una vía clásica de MAPkinasas, donde Ste11 cumple el rol de MEKK, Ste7 el de MEK y Fus3 y Kss1 son dos mapkinasas con funciones redundantes. Por otro, el dímero Ste4-Ste18 también se asocia a otra kinasa, Ste20. De esta manera, en su estado activo, el dímero genera la proximidad entre Ste20 y Ste11, que de otra manera no interactúan de manera eficiente, permitiendo que la primera fosforile y active a la segunda [61 y 63]. Ste11 en su estado activo fosforila y activa a su vez a Ste7 que finalmente fosforila a las dos MAPkinasas. Al activarse, estas proteínas se disocian del complejo estructurado por Ste5 y fosforilan a muchos targets en la célula provocando los cambios necesarios para llevar a cabo la fusión de las células haploides. Uno de los sistemas blanco más importante es el compuesto por el factor de transcripción Ste12 y sus dos inhibidores, Dig1 y Dig2. Las mapkinasas ingresan al núcleo y fosforilan a las 3 proteínas, activando al factor de transcripción e impidiendo la acción de sus inhibidores. De esta manera, se induce la expresión de los genes regulados por Ste12 [61].

Existen alrededor de 200 genes inducidos por Ste12 [63]. Todos contienen la secuencia PRE en su región promotora, que es la secuencia a la que une el factor de transcripción activo, y se pueden clasificar según la función que llevan a cabo. Un primer grupo dentro de estos genes codifica para elementos constitutivos de la misma vía de transducción, como por ejemplo Ste2, Gpa1 o Fus3. Otro grupo está conformado por feedbacks negativos sobre la misma, como Sst2, Bar1 o Msg5 (una proteasa extracelular que degrada al factor alpha y una fosfatasa que inactiva a las mapkinasas Fus3 y Kss1 respectivamente). En su conjunto, se puede pensar que ambos grupos forman parte de los mecanismos regulatorios que modulan el funcionamiento de la vía de señalización[63]. Por último, Ste12 regula un tercer grupo de genes, los involucrados en el mecanismo de apareamiento y arresto del ciclo celular . El gen más conocido y relevante para este proyecto de este último grupo es Far1. Si bien tiene más de una función, el acrónimo con el que se nombra este gen expresa claramente cual es una de sus funciones principales. Far remite a factor arrest y levaduras que no contienen este gen son deficientes en el arresto del ciclo celular inducido por la feromona [63]. Es decir, la inducción y activación de Far1, fosforilada por Fus3, provoca el arresto del ciclo celular de las levaduras como respuesta a la presencia de feromona en el medio [65]. Éste efecto es el que permite utilizar a ésta vía como un mecanismo de detección de melatonina, si se realizan las modificaciones que se explican en el apartado Modificaciones realizadas y funcionamiento del biosensor.

Modificaciones realizadas y funcionamiento del biosensor

Figura 3: Camino de señalización alterado en la cepa de levaduras recombinante

Se realizaron dos modificaciones en el ADN de las levaduras para poder construir un biosensor de melatonina basado en la vía de respuesta a la feromona. Por un lado se reemplazó la región codificante de Ste2 por la de un receptor de melatonina humano, MTNR 1B. Por otro, se reemplazaron los últimos cinco aminoácidos de la extremo C terminal de la región codificante de Gpa1 por los aminoácidos presentes en la subunidad alpha humana, generando una proteína quimera denominada "transplant" [66]. Esta última modificación se basa en que Gpa1 interactúa con el GPCR por su extremo C terminal, por lo que la proteína quimera es capaz de interactuar tanto con el receptor humano por la región modificada, como con el dímero Ste4-Ste18 por la región sin modificar. Según la bibliografía, modificar solamente cinco aminoácidos es suficiente para permitir la interacción eficiente entre el receptor y la Gpa1 modificada y no altera la interacción de esta última con Ste4-Ste18 [66 y 67]. De esta manera, la proteína quimera funciona como un adaptador entre el receptor de melatonina y la vía de respuesta a la feromona, por lo que, en las levaduras modificadas, esta vía es iniciada por la presencia de melatonina. En la Figura 3 se esquematizan las modificaciones realizadas y el funcionamiento de la vía alterada.


Para obtener una respuesta observable asociada a la concentración de melatonina utilizando las levaduras construidas se puede realizar un halo essay [68]. Este test hace uso del arresto del ciclo celular mediado por Far1 para cuantificar la concentración de la hormona. Básicamente, se basa en el crecimiento de un césped de levaduras en una placa de agar inoculada en un punto con una solución con melatonina. La hormona difunde generando un gradiente de concentración desde dicho sitio. Allí donde la concentración de la hormona es suficiente para activar la vía de transducción se inhibe el crecimiento de las células, ya que se induce el arresto del ciclo celular vía Far1, por lo que se genera un halo de NO crecimiento. El diámetro del halo está determinado entre otras variables por la concentración de melatonina en el inóculo. Realizando una curva dosis respuesta de concentración de melatonina vs diámetro, se puede estimar la concentración desconocida de la hormona en una muestra biológica por interpolación. En la Figura 4 se muestra el funcionamiento conceptual del biosensor utilizando como respuesta dicho ensayo.

Figura 4: Ensayo de halo utilizado para la cuantificación de melatonina

Diseño de las levaduras

El flujo experimental propuesto para construir el biosensor consta de dos ramas principales: la sustitución de Ste2 por MTNR1B y la modificación del extremo C terminal de Gpa1. Para llevar a cabo la sustitución se utilizará el sistema CRISPR/Cas9, el cual nos permitirá insertar el cDNA del receptor de melatonina en el genoma de la levadura. Para modificar el extremo C terminal de Gpa1 se diseñarán primers específicos para obtener un producto de PCR tal que, una vez transformado dicho fragmento, el mecanismo de recombinación homóloga de las levaduras nos permita modificar dicha región acotada de la Galpha endógena.

Si bien CRISPR/Cas9 es un sistema muy eficiente para la edición de genes, no se utilizará en el último caso porque no se encontró ningún sitio adecuado a dónde dirigir el gRNA en la secuencia target, también debido a su escasa longitud. Como base de datos para obtener las secuencias de interés se empleó NCBI en el caso de las secuencias humanas y Saccharomyces Genome Database para las de levaduras. Para el diseño de primers, búsqueda de secuencias target y sitios de restricción y visualización de los distintos elementos empleados se utilizó como plataforma a Benchling. Para consultar las secuencias de los primers diseñados referirse a la sección Trabajo en el Wet Lab

CRISPR/Cas9 es un sistema inmune procariótico que otorga resistencia frente a agentes externos tales como fagos. Una endonucleasa, Cas9, corta al ADN en un sitio específico marcado por el “guideRNA” o gRNA, que interactúa con una región complementaria al mismo en el genoma target. Para que esto suceda, ésta región debe estar adyacente a una secuencia llamada protospacer adjacent motif, o PAM. Éste PAM es serie de nucleótidos, de 3 a 5 pb, que el complejo Cas9-gRNA reconoce como ajeno (a la bacteria de la cual proviene), lo que genera que, dentro de un organismo procariota, éste complejo funcione como un sistema de reconocimiento de patrones exógenos, por ejemplo secuencias de ADN viral.

Figura 5: Empleo de CRISPR/Cas9 para el clonado del receptor de melatonina humano MT2

En este caso, transformado dentro de una levadura, el sistema CRISPR/Cas9 funciona como un mecanismo de recombinación homóloga dirigida. Luego que se produce el corte por la endonucleasa Cas9, la levadura reclutará sus sistemas endógenos de reparación del DNA para reparar el daño. Durante este proceso, si existen fragmentos de DNA homólogos a regiones cercanas al sitio de corte, la recombinación homóloga se producirá. En particular, el sistema de reparación de levaduras es altamente eficiente [69]. De esta manera, esta técnica es útil para reemplazar una secuencia endógena por un fragmento de interés. Para hacerlo, se flanquea a este último con extremos homólogos a la secuencia genómica que delimita a la región que se desea reemplazar y por recombinación en ambos extremos se inserta el fragmento de interés, removiendo al endógeno. El proceso se detalla de manera específica para el reemplazo de Ste2 por MTNR1B en la Figura 5.

Este método requiere de tres elementos: el fragmento a insertar, en este caso cDNA humano, un plásmido que expresa Cas9 y un plásmido que expresa al gRNA.

Para obtener el inserto se pretende levantar por PCR la región codificante del gen MTNR1B a partir de cDNA utilizando los primers fwR2 y rvR2 que delimitan dicha región. Luego, se repite la PCR pero con los primers fwR1 y rvR1, que poseen un overhang homólogo a la región genómica que se encuentra a ambos lados del ORF de Ste2 en las levaduras. Como resultado de las dos PCR se obtiene el fragmento flanqueado por las regiones homólogas necesarias (Ver Figura 6).

Figura 6: Diseño de primers para la integración del receptor de melatonina

Por otro lado, para construir el plásmido que expresa al gRNA se utilizará como base al plásmido p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t. Este plásmido tiene el promotor y gen del gRNA pero una secuencia guia distinta a la necesaria. Para reemplazar esta secuencia por una diseñada para dirigir a Cas9 a un sitio de la secuencia de Ste2 se utilizará el sistema de recombinación homóloga de las levaduras o Yeast Gap Repair [70]. Por un lado se digiere al plásmido (o a uno similar) con dos enzimas de restricción flanqueantes al gen del gRNA para obtener el backbone. Por otro, se realizarán dos PCR utilizando como molde al mismo plásmido. Una PCR levanta un producto delimitado por un primer reverse río arriba de la secuencia guía presente en el mismo, rvP1, y la otra levanta un producto delimitado por el forward en la región río abajo de dicha secuencia, fwP2. En el primer caso el primer forward de la PCR es T3, y en el segundo el reverse esT7. Ambos primers se encuentran por fuera de la región removida por las enzimas de restricción del backbone. Además, rvP1 y fwP2 poseen como overhang a la secuencia guía diseñada contra Ste2, una secuencia complementaria a una región interna de Ste2 que posee los motivos necesarios para ser reconocida por el gRNA (PAM site). De esta manera, ambos productos de PCR obtenidos tienen un extremo homólogo entre sí y otro homólogo al backbone. Por esta razón, si se transforman en conjunto los tres fragmentos, el plásmido se ensambla por recombinación homóloga dentro de las levaduras.Todo el proceso se esquematiza en la Figura 7.

Figura 7: Los productos de PCR obtenidos se ensamblan por Yeast gap repair para dar el plásmido gRNA
Figura 8: Homologous end joining en levaduras del cassette que contiene a la Galpha "transplant" y el marcador de selección KAN


Como se dijo anteriormente para modificar el extremo C terminal de Gpa1 se pretende insertar un fragmento sintético utilizando la recombinación homóloga de levaduras [71]. Si bien este proceso es altamente eficiente en estos microorganismos, es menos eficiente que otros métodos como CRISPR/Cas9, por lo que requiera de un marcador de selección para distinguir a las levaduras recombinantes de las que no lo son. Por esta razón, para construir el fragmento a insertar se diseñaron dos primers capaces de levantar el gen de resistencia a kanamicina desde un molde adecuado. Como overhang del primer forward, fwG1, se colocó una secuencia homóloga a la región río arriba de los 5 codones a modificar, seguida de los codones humanos, y en el reverse, rvG1, una secuencia homóloga a la región inmediatamente río abajo del codón stop de Gpa1. De esta manera, como producto de PCR se obtiene un fragmento capaz de insertarse por recombinación homóloga en la región terminal de Gpa1, que porta la secuencia humana y al marcador de selección. Este proceso se esquematiza en la Figura 8.


Figura 9: Controles positivos y negativos de la integración de la Galpha "transplant" y el receptor MT2



Para controlar ambas modificaciones se diseñaron dos tríos de primers, uno para cada construcción. En ambos, se utilizará un primer reverse complementario a una región genómica río abajo de la construcción correspondiente. Para el receptor este primer es el rvR3/5 y para el transplant es rvG3/4. El control positivo en cada caso se completa con un primer forward dentro de cada construcción, fwR3 para el receptor y fwGTEF para Gpa1, y el negativo con otro primer forward pero complementario a la secuencia endógena removida, fwR5 para el receptor y fwG4 para Gpa1. Todos los primers mencionados se representan en la Figura 9.

Originalidad y carácter innovador

Actualmente el estado del arte en la medición de los niveles de melatonina en fluidos corporales consta de técnicas sofisticadas y laboriosas tales como la espectrometría de masas (MS) o los radioinmunoensayos. No obstante, existen técnicas con protocolos más sencillos tales como ELISA, pero aún resultan muy costosas (Ver sección 1.7 Métodos actuales para la determinación de los niveles de melatonina).

Hoy en día no existe ningún método de medición que permita determinar melatonina en fluìdos corporales que esté basado en el empleo de un biosensor...

Hasta que un grupo de estudiantes desarrolló Chronosense, una plataforma simple, barata, robusta y eficaz.

Chronosense emplea el receptor humano de melatonina MT2 para sensar la melatonina presente en la muestra de interés (Ver sección Implementación de la solución. Esto, sin lugar a dudas, lo hace altamente específico, emulando el mecanismo de sensado endógeno (en referencia a la interacción ligando-receptor) y así evitando las reacciones cruzadas que, por ejemplo, ocurren con frecuencia en los métodos inmunoquímicos.

Chronosense combina el uso de una técnica corriente y simple en biología molecular de levaduras, el ensayo de halo, con la generación de una cepa de levadura recombinante encargada de sensar la melatonina.

Así, en la conjunción de estas dos tecnologías, es como emerge nuestra plataforma de diagnóstico molecular.

Decidimos ser ambiciosos y no dudar en llamarla plataforma de diagnóstico molecular ya que bajo el mismo concepto se podrían sensar muchas otras moléculas de interés cuyos receptores endógenos también fuesen GPCRs. Sólo bastaría con generar nuevas cepas de levaduras con los protocolos ya empleados. Con lo cual Chronosense podría ser sólo la punta del iceberg, abriendo el camino a la creación de nuevos biosensores.

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