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Objetivo general

Como meta nos decidimos desarrollar una forma sencilla, rápida y de bajo costo para detectar la presencia de glifosato, tanto en muestras de suelo como de agua. Con este fin, desarrollaremos una bacteria Escherichia coli modificada genéticamente, sensible al metabolismo del herbicida y a su producto de degradación, que actuará como detector de ambos, lo que será útil para posteriores estudios de contaminación por agroquímicos. [1]

¿Qué es el glifosato?

Fórmula química del glifosato

El glifosato es un herbicida no selectivo de amplio espectro, desarrollado para eliminar hierbas y arbustos, en especial perennes. Originalmente ha sido para ser aplicado en hojas, sin embargo,se puede inyectar en troncos y tallos o pulverizarse a tocones como herbicida forestal.

Desde un punto de vista químico, el glifosato es un aminofosfonato, cuyo principio activo es un derivado de la glicina, donde uno de los átomos de hidrógeno de este aminoácido está reemplazado por un grupo fosfonometil.

Una vez absorbido por la planta, el glifosato se une a la enzima EPSPS(enolpiruvilsiquimato-3-fosfatosintasa) y la bloquea. Esta enzima es la responsable de convertir a los precursores carbohidratos simples derivados de la glucólisis y la vía de la pentosa fosfato en aminoácidos aromáticos, como la fenilalanina y la tirosina, y otras metabolitos importantes en la planta. La EPSPS normalmente se encuentra dentro de los cloroplastos, donde cataliza la reacción de sikimato-3-fosfato (S3P) y fosfenolpiruvato para formar 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato (ESP). Las similitudes estructurales que tiene el glifosato con el fosfenolpiruvato le permiten unirse al lugar de unión de sustrato de EPSPS para inhibir su actividad, lo que eventualmente provoca la muerte de la planta a causa de la desnutrición.


Composición y Degradación del Glifosato

El glifosato es un derivado del aminoácido glicina, con ácido fosfónico unido al grupo amino, (N-fosfonometilglicina) siendo su fórmula C3H8N05P. La degradación microbiana es considerada el proceso de transformación más importante que determina la persistencia de herbicidas en el suelo. En el caso del glifosato, el principal producto de degradación es el ácido aminometilfosfónico (AMPA) y en menor grado el glioxilato.


Persistencia y Biodegradación del glifosato

Rutas de degradación del glifosato

El glifosato tiene escasa o nula actividad en el suelo dado el rápido potencial de adsorción por parte de las partículas orgánicas e inorgánicas del mismo. En contraste, muchos estudios muestran que el glifosato está disponible como sustrato para las comunidades microbianas en el suelo y en la rizosfera, permitiendo aumentar la biomasa y la actividad microbiana. (Conde et. Al, 2011)

En el suelo, el glifosato es fuertemente adsorbido por los minerales de arcillas y materia orgánica, compitiendo con el fósforo por sus sitios de unión. (Nieto et. Al, 2012). Los suelos arcillosos adsorben más el glifosato y el AMPA que los suelos arenosos, quedando menos expuestos a la degradación microbiana, aunque dicha adsorción no es permanente. A su vez, han demostrado que suelos con agregado de fertilizantes fosfatados aumentan la cantidad de glifosato disponible, dado que los sitios de adsorción están ocupados por iones fosfatos. (Conde et. Al, 2011).

Por lo tanto, el glifosato que queda en la solución del suelo puede ser absorbido por las raíces de las plantas, ser metabolizado por los microorganismos o alcanzar aguas sub-superficiales. (Conde et. Al, 2011). En suelo el glifosato es degradado por microorganismos edáficos, en dependencia del tipo de suelo, concentración de nutrientes, pH, temperatura y humedad (Nieto et. Al, 2012).

Sasal et. Al., 2010 sus estudios de contaminación de agua mostraron persistencia de Glifosato y AMPA en el agua de drenaje y de escurrimiento, en coincidencia con lluvias de primavera que favorecerían el pasaje rápido de agua hacia la capa freática o hacia cursos de agua superficial. Aunque las concentraciones y las cantidades de glifosato y AMPA que salió del sistema por drenaje y escurrimiento resultaron bajas, representando menos del 0,03 y menos del 0,6% de las cantidades aplicadas, respectivamente.

Maitre et. Al., 2010, describe que los resultados obtenidos a partir de las experiencias realizadas en el INTEC indicaron desorciones promedios entre el 51 y el 69% utilizando el producto puro y el comercial. Sus resultados indican porcentajes relevantes de glifosato desorbido. Esta información es importante ya que, si el glifosato se desorbe y es lixiviado a horizontes inferiores, existiría menos posibilidad de que sea degradado en condiciones anaeróbicas y aumentaría el peligro de contaminación.

Microorganismos Degradadores de Glifosato

Los microorganismos, principalmente las bacterias, son capaces de catabolizar compuestos organofosfonados, los cuales utilizan como fuente de carbono, nitrógeno y fósforo. Las bacterias degradan el glifosato por dos vías, produciendo como intermediarios glicina o ácido aminometilfosfónico (AMPA)(Nieto et. Al, 2012)

Conde et. Al, 2011 logró aislar cinco géneros bacterianos que utilizaron el glifosato como única fuente de carbono, predominando Pseudomonas spp. con un 42, 9  %. Estos resultados concuerdan con varios estudios, los cuales han encontrado degradación del glifosato y de otros compuestos organofosfonatos por diferentes microorganismos del suelo, principalmente por varias especies del género Pseudomonas spp.xiii Pero a diferencia, estos estudios aislaron estas bacterias edáficas en medios de cultivo donde el glifosato se usó como única fuente de fosforo.

De todas formas, la regla general es que los microorganismos del suelo lo utilicen como fuente de fosforo, debido a que estos investigadores comprobaron que el glifosato es mejor fuente de fosforo que de carbono. (Shushkova et al. 2009 y Moneke et al. 2010 c.p. Conde et. Al, 2011)

Las especies aisladas por Conde et. Al, 2011, del genero Pseudomonas spp. teniendo glifosato como única fuente de carbono, fueron cercanas a P. cichorii,P. aeruginosa, P. fluorescens, P. stutzeri y P. vesicularis. También se aislaron cepas cercanas a Burkholderiacepacia , B. gladioli, Alcaligenes sp., Flavimonas oryzihabitansy Pantoea aglomerans.


Relevancia del problema

Ante la creciente y constante demanda mundial de alimentos, la superficie agrícola, tomada como áreas sembradas, se incrementó al igual que los rendimientos de los principales cultivos de grano. Esta expansión se vio favorecida por la fuerte adopción de la siembra directa, los estudios en biotecnología, la utilización de fertilizantes y la incorporación al sistema de los productos fitosanitarios.

Actualmente, existe una marcada tendencia al aumento y la difusión de cultivos transgénicos, con resistencia a ciertos herbicidas. Como ejemplo podemos citar a los cultivos transgénicos tales como maíz RR, soja RR y algodón RR, los cuales presentan resistencia al herbicida glifosato.

Al contar con cultivos resistentes al glifostato, este se volvió masivamente usado para controlar a las malezas perjudicales. A su vez, su bajo costo relativo y la gran eficacia que presenta lo convirtieron en uno de los herbicidas más utilizados a nivel mundial. Distintas formulaciones de glifosato están registradas en más de cien países, para su uso en más de sesenta cultivos agrícolas, en manejo de bosques sometidos a intervención para su conservación, y en sistemas cultivados diferentes, incluidos el mantenimiento de vías y canales, y los espacios verdes.

Este producto químico puede ser degradado en el suelo por acción principalmente bacteriana a su metabolito, el ácido aminometil-fosfónico (AMPA), y dióxido de carbono. El AMPA es más persistente en el suelo que el glifosato con vidas medias de entre 199 y 958 días, con estudios actuales para determinar su toxicidad. También es más móvil en el suelo y se encuentra a menudo en las aguas subterráneas, plantas y alimentos en concentraciones más elevadas que el herbicida.

El glifosato ha sido fabricado para ser aplicado directamente a las hojas de las plantas, pero si es aplicado incorrectamente, puede producirse la deriva del producto y llegar al suelo. Si las aplicaciones son repetidas, el glifosato y sus residuos, pueden acumularse en el suelo, actuando como agentes de selección en la microbiota. Esta selección trae consecuencias adversas en la fertilidad del suelo en el largo plazo debido a que los microorganismos del suelo son responsables de la ejecución y el control de funciones esenciales como la descomposición de la materia orgánica, producción de humus, reciclaje de nutrientes, fijación de nitrógeno atmosférico, solubilización de nutrientes vitales como el fósforo, descomposición de xenobióticos y también control biológico de plagas y enfermedades, entre otros.

A su vez, la unión entre el glifosato y los rastrojos del cultivo es marcadamente menor que con el suelo, lo que incrementa los riesgos ambientales potenciales como el escurrimiento superficial del herbicida hacia los cursos de agua .

También existen investigaciones que demuestran que el glifosato puede ser absorbido por las plantas y concentrarse en las partes que se usan como alimento, así sus residuos pueden entrar en la cadena alimentaria. Por ejemplo, después de su aplicación, en EEUU., se han encontrado residuos de glifosato en frutillas, moras, frambuesas, lechugas, zanahoria y cebada. De esta forma los seres humanos están expuestos al glifosato tanto a través de alimentos, como por acumulación en los cursos de agua o por trabajar con el herbicida. Se ha demostrado que la exposición al glifosato puede traer abortos espontáneos, ya que resulta tóxico para las células placentarias humanas JEG3, incluso con concentraciones consideradas no tóxicas. Este efecto aumenta con la concentración y el tiempo. A su vez, se ha demostrado que AMPA es más tóxico que el Glifosato para las células humanas, especialmente a nivel de las membranas celulares.

Es por ello, que se ha tornado importante contar con una herramienta que permita detectar la presencia del herbicida más usado en el mundo. Decidimos trabajar con E. coli, siendo la bacteria más usada y estudiada hasta la actualidad. Tras un extenso trabajo de investigación, encontramos genes implicados en la degradación de glifosato como también de enzimas sensibles frente a ciertos compuestos. Mediante técnicas de laboratorio, tales como ampliación genética, electroforesis, corte y pegado de plásmidos, etc. llevamos a cabo el trabajo de unir todo lo necesario para que E. coli se vuelva un eficiente detector de glifosato.