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En la actualidad la gran mayoría de los cultivos comerciales en todo el mundo utilizan un herbicida no selectivo de amplio espectro llamado "Roundup", el cual contiene como principio activo al glifosato y como principal derivado al AMPA (ácido aminometilfosfónico). El tema de los agroquímicos en la actualidad es muy controversial ya que hay muchas dudas acerca de cómo actúan en el medio ambiente y en la salud humana. En sí mismo, el AMPA no se sabe con exactitud su movilidad en el suelo, en aguas o en la atmósfera, ni el índice de bioacumulación y toxicidad en los cultivos. Por lo que hemos decidido identificarlo en condiciones de laboratorio a través de bacterias manipuladas genéticamente para poder alertar a la sociedad sobre la importancia de lo que esta consumiendo.

Encontramos que ciertos organismos del suelo degradan glifosato mediante la enzima C-P liasa, la cual como su nombre lo indica, rompe el enlace C-P del compuesto, dando como subproductos sarcosina y fosfatos. Esta enzima se la encontró en la especie Rhizobium meliloti, la cual secuenciamos. Una vez que la bacteria modificada haya roto ese enlace, mediante la incorporación de los genes para dicha enzima, los fosfatos libres en el medio serán detectados por la enzima PhoA presente en su genoma y por un primer del gen reportero de coloración elegido. Así, la bacteria que se torne azul será la evidencia de que en esa muestra había glifosato. Para asegurarnos de que la bacteria detecte glifosato y no sólo fosfato, se hace previamente un control agregando a la muestra bacterias que cuenten sólo con el gen PhoA.


Bacteria E. coli

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Para comenzar a trabajar contamos con una cantidad suficiente de E. coli DH5 alpha, dispuesta por la cátedra de Bioquímica de la facultad. A las mismas, las volvimos competentes siguiendo el protocolo más usado para ello, siguiendo los siguientes pasos: En un erlenmeyer con 500 ml de medio LB se incubó con 10 ml de bacterias DH5 (crecidas a 37º C toda la noche a partir de una colonia aislada) hasta llegar a una DO660m 0,45-0,55. Se pasó a 2 tubos de 250 ml y se centrifugó a 3500 r.p.m. 10 min. A 4º C. Se descartó el sobrenadante y se resuspendió el precipitado en 100 ml de TFB I y se incubó 15 min en hielo. Se centrifugó a 3500 r.p.m. 10 min a 4 C y se resuspendió en 20 ml de TFB II. Se incubó en hielo durante 15 min. Luego se alicuotó en tubos con 50 o 100 l de la suspensión de células, que fueron congelados en nitrógeno líquido y guardados a -70 C hasta el momento de usar. Los plásmidos de interés los enumeramos, siendo el 1 el repotero, el 3 el terminador y el 4 el promotor. Una vez competentes, transformamos a las bacterias con los plásmidos indicados siguiendo los pasos de usar 5 l de ligación con 50 l de bacterias competentes DH5, a las que se incubaron 40 min. en hielo. Por otro lado se colocó el plásmido comercial sin inserto, con 50 l de bacterias competentes para usarlo como control de eficiencia de transformación. Al cabo de ese tiempo se dio un shock térmico de 1,5 min. a 42° C, se colocó nuevamente en hielo por 5 min., se le agregó 1 ml de medio LB o SOC y se incubó durante 45 min. para la recuperación de las células y la expresión del gen de resistencia al antibiótico en placas de LB-agar con antibiótico. Se incubó toda la noche a 37°C. Luego, se separaron los plásmidos por un lado y por otro ARN. Se corrió para ver los resultados, notándose una banda de aprox 700 pb y otra mucho más pesada que correspoden al material genético.

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