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From UNAM - Cuernavaca
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Resúmen

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El descubrimiento de que proteínas derivadas de la cpaside de rotavirus se autoensamblan en nanoestructuras de diversas morfologías, ha brindado la propuesta de utilizarlas como agentes nanotecnológicos. El potencial de bioproducir nanoestructuras, aunado al descubrimiento de que los nanotubos de vp6 son funcionalizables con metales nos llevó a idear nuestro proyecto. En el proyecto Rottascaffold buscamos desarrollar un andamiaje nanotecnológico con multiples aplicaciónes, desde vacunas y presentación de antígenos hasta la mejora de rutas biosintéticas.


Introducción

MM Arnold, JT Patton - Viruses, 2009
Existe un virus conocido como “Rotavirus” el cual de doble cadena de ARN cubierto por una capa triple en forma de icosaedro (a lo que nos referiremos como capside). La capside está compuesta en la parte externa por proteínas virales llamadas “VP4” y “VP7”, la capa de en medio esta formado por la proteína “VP6” y la capa interna es formada por otra proteína con el nombre de “VP2”. Ahora bien ¿Qué es lo interesante estas capas? Nos resulta interesante que la capa intermedia, formada por VP6, tiene la magnífica propiedad de autoensamblarse en diferentes estructuras que dependen del pH o la cantidad de iones en el medio (a lo que le llamamos fuerza iónica). Además estás estructuras pueden acoplarse a metales como oro, plata y paladio ¿se les ocurre alguna aplicación para esta peculiar característica?

Además es importante que las interacciones entre las diferentes proteínas que componen la capside del rotavirus han sido descritas, por ejemplo, VP7 interactúa con VP6 a través de 30 aminoácidos (que parecen forma un gancho). Aunado a lo anterior VP4 –que forma una especie de estructuras con forma de picos- ha sido descrito como una proteína de adhesión viral. Estas interacciones biológicas y las características de VP6 mencionadas anteriormente pueden ser modificadas y explotadas en un contexto de biología sintética.

RM Castro-Acosta, WA Rodríguez-Limas… - Microbial cell factories, 2014

Objetivo

La biología sintética puede ser definida como un campo de investigación emergente que combina enfoques biológicos e ingenieriles en el diseño, desarrollo y estudio de nuevos sistemas biológicos con nuevas propiedades y aplicaciones. Es por ello que en este proyecto nosotros proponemos un sistema de expresión que permita generar un andamiaje multifuncional y con la propiedad de que se autoensamble a partir de las proteínas antes mencionadas y con el enfoque de biología sintética. Este andamiaje consistirá de nanoestructuras formadas por subunidades de VP6 unidas por un conjunto de péptidos adaptadores, los cuales también se les pueda adosar cualquier clase de enzima, epítope o proteína de interés que queremos unir al andamiaje. Es decir, nuestro objetivo es generar “linkers” o péptidos adaptadores que interactúen con las nanoestructuras de VP6, en primera instancia emplearemos las interacciones antes descritas de VP4 y VP7 para generarlos y posteriormente evaluaremos la capacidad del andamiaje de acelerar reacciones enzimáticas sin necesidad de sobreexpresión de proteínas (nuestro modelo vs sistemas clásicos de expresión), para esto hemos decidido probar con la ruta de violaceína. De igual manera, una aplicación que nos interesa es adosar epítopes a las nanoestructuras de VP6, con ello generar una respuesta inmune y de esta forma obtener vacunas recombinantes eficientes y seguras. En las siguientes secciones describiremos un poco más acerca de los módulos individuales de nuestro proyecto que son:

1. Generar Linkers.

2. Expresión de VP6 en E. coli.

3. Evaluar el sistema con una prueba de concepto.

Linkers

Los péptidos adaptadores o linkers del andamiaje se diseñaron y construyeron aprovechando la característica de los interactuantes nativos de VP6 (VP7 y VP4). Las dos principales partes del diseño incluyen: 1) un dominio de unión con VP6 y un espaciador (para mejorar la actividad biológica, incrementar el rendimiento de expresión, mejorar el plegamiento y la estabilidad de la enzima de interés) y 2) la enzima de interés que se desee
Rottascaffold proyect
unir. La creacion de estos peptidos se basa en el método de ensamble PCR assembly. La ventaja de este enfoque radica en tomar las bases de la biología sintética al proponer un sistema universal, ya que estandarizará el péptido de unión y lo que varía es la enzima de interés. Una gran ventaja de este sistema modular, es la capacidad de estandarizar y generar una herramienta tipo "kit" que permita a cualquier inverstigador aprovechar el nanoandamiaje. Para determinar los dominios de unión se realizaron búsquedas bioinformáticas y en la literatura. Esto permitió inferir la secuencia de los linkers basados en la interacción natural entre vp7 y vp4 con vp6. La secuencia específica de estos peptidos esta disponible previa solicitud.

Expresión de nanoestructuras de VP6 en E.coli

Las VLP (virus like particles) son proteínas virales que conformaban a un virus. El avance en la capacidad de producir estas proteínas ha permitido su estudio a fondo, sin el riesgo asociado de tratar con virus. Particularmente se han descrito como posibles agentes inmunoreactivos (que causan una respuesta inmune), promoviendo la generación de anticuerpos y linfocitos de memoria. Esto quiere decir que básicamente se pueden generar vacunas que consistan únicamente de VLPs, disminuyendo el riesgo de una infección real presente en las vacunas de agentes infecciosos inactivados. Sin embargo, las VLPs normalmente se autoensamblan, y aveces pueden formar nanoestrcuturas como esferas o tubos. Esta capacidad de autoensamblarse ha generado un interes en su utilización en la nanotecnología. Nosotros nos interesamos particularmente en la proteína de capside del rotavirus vp6, pues es capaz de formar nanotubos y nanoesferas que son funcionalizables (se les pueden adosar) con distintos metales. Estudios de estas nanoestructuras han demostrado que la utilización de nanotubos como vacuna recombinante brinda una mejor protección que las esferas, y que la proteína ensamblada en trímeros.

Usando E. Boby constructor de nanoestructuras

Uno de nuestros objetivos es la bioproducción sencilla de nanoestructuras formadas por la proteína de cápside vp6 en E.coli . Se ha reportado la formación de cuerpos de inclusión, lo cuales son difíciles de purificar y de utilizar para algún fin biotecnológico. Se cree que la formación de cuerpos de inclusión es debido a la cantidad de proteína producida, por lo tanto la simple reducción de la temperatura de crecimiento podría aumentar la recuperación de proteína nativa. Hemos realizado un modelado matemático de la expresión y formación de agregados de vp6, que concuerda con la noción de que los agregados se forman por una producción demasiado rapida Modelado. Otros elementos para optimizar esto puede ser la adición de fuentes de carbono no metabolizables y la utilización de promotores débiles. Otro factor asociado con la formación de cuerpos de inclusión es la hidrofobicidad de las proteinas, por lo tanto una fusión de la proteína de interés con SODA o glutation-S-transferasa disminuirá la formación de cuerpos de inclusión. Por otra parte también existe la posibilidad de intentar renaturalizar el cuerpo de inclusión. Un ambiente oxidativo parece afectar negativamente la formación de nanotubos de VP6.

Coli constructora

Dependiendo del tipo de proteína existen distintas estrategias a utilizar para evitar los cuerpos de inclusión las principales son co-expresion de chaperonas y exportación a periplasma (para proteínas con muchos puentes disulfuro). Interesantemente, se han hecho estudios que analizan la protección de ciertas proteínas mediante la adición de agentes antioxidantes y enzimas antioxidantes. Para lograr la expresión de estructuras de vp6 en E. coli y evitar la formación de cuerpos de inclusión se combinaran una serie de estrategias:

1.- Coexpresión con enzimas antioxidantes:

De esta manera se evitará el daño a las subunidades de las nanoestructuras, evitando que se disrumpiera el autoensamblaje.

2.- Utilización de un promotor y rbs con actividad moderada, antes modelado y probado con titulación de IPTG

Evitando así una rápida producción de las subunidades y un plegado incorrecto de las mismas.

3.- Producción en la cepa Rosseta-Gammi B (DE3) Esta cepa contiene un plásmido con tRNAs para evitar la necesidad de optimización de codones, también expresa chaperonas y proteínas reductoras en el citosol para evitar el daño oxidativo de las proteinas. Al tener una polimerasa del fago T7 bajo el systema Lac, se podria modular la expresion de VP6 al hacer una titulación de inducción por IPTG y cuantificando la formación de cuerpos de inclusión.

Prueba de concepto

Con el objetivo de evaluar la efectividad de nuestro andamiaje, fusionaremos los adaptadores derivados de VP4 y VP7 a enzimas de una ruta que nos permita cuantificar la producción de un compuesto. La ruta que escogimos fue la de la violaceína, una vía previamente usada en biología sintética, capaz de generar un producto e intermediarios cuantificables. Además, la violaceína así como sus derivados cuentan con potencial farmacéutico, ya que han sido de interés en el desarrollo de antibióticos, antiúlceras e incluso como medicamentos contra el cáncer.

Fusionaremos los adaptadores a las enzimas de la ruta de la violaceína y coexpresaremos tanto el andamiaje como las fusiones adaptador-enzima en nuestro sistema de E. coli. El aumento de eficiencia será medido a través de la cuantificación por absorbancia del pigmento producido, tomando como control la producción por métodos usuales como la sobreexpresión de enzimas. Esperaremos que nuestro andamiaje lleve a un mayor rendimiento que el control debido al incremento local de concentración enzimática y la formación de un sistema de canalización por sustrato.


Aplicaciones: Vacunas

Vacunas-recombinantes.jpg
Una de las aplicaciones a explotar en nuestro proyecto es la realización de vacunas recombinantes, estas son las producidas a través de DNA recombinante. Esto involucra el inserto del DNA que codifica para un antígeno el cual estimula una respuesta inmune. La diferencia entre las vacunas recombinantes y las vacunas normalmente usadas (atenuadas o inactivadas) es que estas últimas tienen en forma “latente” al virus, lo que significa que en cualquier momento pueda regresar al fenotipo de virulencia afectando a aquellas personas que hayan sido vacunadas. En los países de más bajos recursos si se les inyecta el virus atenuado - debido a que no existen practicas constantes de salud, ni seguimiento de la enfermedad – el virus puede revertir su virulencia, afectando a la población. Por otro lado, las vacunas recombinantes no proporcionan peligro alguno a la población y no es necesario el chequeo constante de la misma.

La vacunas recombinantes son una nueva clase de vacunas que tiene propiedades únicas y atractivas las cuales incluyen seguridad, facilidad de desarrollo y economía. Su impacto ya es un hecho debido a que ha sido aprovechado para generar vacunas contra hepatitis B y el virus del papiloma, entre otros.