Bitacora

From UNAM - Cuernavaca
Jump to: navigation, search


B synbio.png B rota.png B modelado.png B synthetic.png B team.png B problem.png B human.png B financiamiento.png B notebook.png


Amplificación de VP6

Estructura VP6

Para poder amplificar VP6 se diseñaron oligos, uno de ellos incluye un sitio de unión al ribosoma (RBS). Mediante un ensayo de PCR se amplificó VP6 a partir de una extracción de DNA genómico de rotavirus SA11. Dichos oligos fueron previamente fosforilados para que al amplificar la secuencia de VP6 éste tuviera un residuo de fosfato, útil al momento de ligar la secuencia de VP6 a un vector.

Se utilizó la cepa de E. Coli DH5α para expresar VP6. Las cuales fueron transformadas químicamente siguiendo un protocolo estándar de transformación de células quimiocompetentes.




Digestiones y ligaciones estándar

Formación de una molécula de DNA recombinante

La forma de insertar un fragmento de DNA a un vector es mediante digestiones realizadas en los sitios estándar Prefijo y Sufijo de las biopartes, se usaron las enzimas de restricción EcoRI-XbaI, SpeI, PstI al momento de digerir las secuencias de DNA, siguiendo los protocolos sugeridos por los fabricantes de las enzimas, los cuales en su mayoría constan en el uso del buffer Cutsmart, la enzima, el fragmento de DNA a digerir, y dejándolas a incubar a 37 °C durante aproximadamente 12hrs.



Esquema de los linker diseñado

Ensamble de los linkers

Las construcciones de los linkers fueron diseñadas para ser ensambladas en dos ensayos de PCR. Se diseñaron dos pares de oligos para su amplificación, un par para poder amplificar la parte interna y el otro para para la parte externa.

Se utilizará la técnica PCR assembly para introducir los linkers a un plásmido.


Amplificación de antioxidantes

Tomando como punto de partida la evidencia de que los radicales libres pueden desestabilizar las VLPs (Virus Like Proteins), el equipo decidió que se debían expresar proteínas antioxidantes y añadirlas a las construcciones. Las proteínas antioxidantes usadas son HPI y SOD, se amplificaron a partir de una extracción de ADN de E.coli.



Construcciones

Construcciones en plásmido estándar PSB1T3

PSBIT3+P1003+J23102+VP6: el plásmido PSB1T3 confiere resistencia a Tetraciclina, la cual es complementada con el promotor P1003 que contiene resistencia a Kanamicina, J23102 tiene la secuencia para expresar Red Fluorescent Protein.

HPI+SOD+VP2+VP6: HPI y SOD son antioxidantes, VP6 en presencia de VP2 forma esferas.

pJET + VP6: el plásmido pJET contiene gen de resistencia a ampicilina.


Expresión de RFP por promotor J23102

Bio partes usadas

PSB1T3: plásmido con resistencia a tetraciclina de alto número de copias (anexe view del plásmido)

J23102: promotor con RFP río abajo.

P1003: Casete de Kanamicina, que incluye promotor y secuencia codificante.



Produccion de VP6 en Rossetta Gammi B

La secuencia de la cepa de Rottavirus que se utilizó, contenía una serie de codones no óptimos para la expressión en Eschericcia coli por lo que se decidio utilizar una cepa especial, Rossetta Gammi B DE3 (RGB) para permitir una produccion estable del mRNA. La cepa RGB tiene una serie de ventajas cuando se habla de bioproducción de proteínas raras, todas beneficas para ser utilizada en nuestro proyecto, pues conjunta las ventajas de las cepas BL21, Rossetta y Origami.

Ventajas de RGB DE3

  • Contiene un plásmido pRARE que contiene los tRNAs con los codones AGG, AGA, AUA, CUA, CCC, y GGA
  • La mutacion en gor y trxB permiten un citoplasma reductor, aminorando el daño a vp6 por oxidación.
  • La cepa es lisogenica para el fago T7, y su polimerasa es inducible por IPTG (BL21-DE3), lo que permite controlar la expression del gen de interes.

La principal cuestion que surgió, fue que esta cepa es resistente a tetracciclina, kanamicina y cloramfenicol por lo que es imprescindible usar otros antibioticos para su selección.

Transformación de RGB DE3

Bacterias trabajando
Protocolos clasicos para generar celulas quimicompetentes resultaron en muy bajas eficiencias de transformacion (nula). Por esto se generaron células electrocompetentes de RGB DE3 utilizando el protocolo de "Richard lab en open wetware" http://openwetware.org/wiki/Richard_Lab:Preparing_electrocompetent_cells. Después estas celulas fueron transformadas utilizando una ligación del plásmido pJET con vp6.El vector de cloneJet contiene una secuencia que genera un gen letal si el plasmido se religa sin una inserción, por lo que reduce la cantidad de falsos positivos. Adicionalmente, el gen es insertado bajo el promotor de la T7 polimerasa, con lo cual nos es posible interrogar los niveles de expressión optimos para generar nanoestructuras y reducir la formación de agregados. Nuestro Modelado predice que niveles bajos de induccion por IPTG brindaran una mayor proporcion de nanoestructuras contra agregados, esta transformacion nos permite realizar esta titulacion in vitro, y asi identificar que combinacion de promotor constitutivo y rbs evitara la formacion de agregados.

Union de los peptidos linker a tu enzima de interes

Los peptidos linker se pueden fusionar a cualquier bioparte de distintas maneras. Estrategias como PCR extension overlap y LCR assembly son de árticular interes porque permiten controlar el orden y sentido de las fusiones. También se probó utilizando ligaciones en blunt, con las desventajas que conlleva como inserciones en orden contrario y religación del plasmido.